基于优化反相液相色谱-质谱联用技术揭示小鼠年龄与饮食相关氧固醇代谢谱的研究
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时间：2025年10月01日
来源：Journal of Separation Science 2.8
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本研究开发了一种无需衍生的反相液相色谱-质谱（RPLC-MS）方法，成功实现了8种结构相似的氧固醇异构体（包括7α/7β-OHC、5,6α/β-EC等）的同步定量分析。通过优化色谱柱类型（C18/C8）、流动相（ACN/MeOH）和低温（25°C）条件，解决了传统分析中难以分离同质谱过渡态（m/z 385.4→367.5）异构体的技术难题。应用该方法发现脑特异性标志物24(S)-OHC随年龄增长而升高，而5,6α-EC在肝脏中的水平同时受年龄和高脂饮食调控，为研究胆固醇代谢在衰老和代谢性疾病中的作用提供了新见解。
结构相似的氧固醇如7α-羟基胆固醇（7α-OHC）、7β-羟基胆固醇（7β-OHC）、7-酮基胆固醇（7-KC）、5,6α-环氧胆固醇（5,6α-EC）、5,6β-环氧胆固醇（5,6β-EC）、24(R/S)-羟基胆固醇（24(R/S)-OHC）、25-羟基胆固醇（25-OHC）和27-羟基胆固醇（27-OHC）在反相液相色谱（RPLC）中传统上难以分离。本研究提出了一种简单且高度优化的方法，使用RPLC与质谱（MS）联用，无需衍生化即可同时定量八种氧固醇。在较低柱温（25°C）下，通过固定相和流动相的特定组合，实现了大多数氧固醇的最佳分离，特别是对于异构体对如7α-/7β-OHC、5,6α-/5,6β-EC、24 R/S-OHC和25-OHC。尽管某些分析物（如24S-OHC和27-OHC）由于相似的保留行为仍然难以分离，但它们可以通过独特的MRM过渡进行区分。我们将此方法应用于一项纵向小鼠研究中，比较正常饮食和高脂饮食下氧固醇的变化。对肝脏和脑样本的分析揭示了两器官之间不同的分布模式。值得注意的是，24(S)-羟基胆固醇水平（一种仅在大脑中产生的特征性胆固醇代谢物）随年龄增长而增加，与饮食无关。相反，肝脏中5,6α-环氧胆固醇的产生受年龄和饮食因素的影响。我们的方法为研究氧固醇变异及其在衰老和饮食中的意义提供了一个强大的工具，为不同生理条件下胆固醇衍生脂质调控提供了新的见解。
氧固醇是胆固醇的氧化衍生物，在胆固醇代谢、信号传导和疾病病理学中起着至关重要的作用。氧固醇可以通过酶促或胆固醇自动氧化形成。例如，7α-OHC、7-KC、5,6α-EC和25-OHC可以通过两种途径产生。7β-OHC和5,6β-EC主要通过自动氧化产生。一些氧固醇是器官特异性的：24S-OHC几乎仅在大脑中酶促产生，而27-OHC主要在肝脏中酶促产生。肝脏通过胆汁产生和消除氧固醇，在调节氧固醇水平中起着核心作用。24(S)-OHC和27-OHC也可以穿过血脑屏障（BBB）并影响脑胆固醇合成，突出了它们在肝-脑轴中的作用。
异构体如7α-/7β-OHC、5,6α/β-EC和24 (R, S)-/25-/27-OHC具有非常相似的结构，但表现出不同的生物学效应。7α-OHC是胆固醇分解代谢和胆汁酸合成的关键中间体，维持脂质稳态。该途径的失调与代谢和心血管疾病有关。其异构体7β-OHC主要与氧化应激和病理状况相关，导致炎症和细胞毒性。5,6α-EC代谢成oncosterone，促进乳腺癌中的肿瘤生长。然而，它也可以转化为dendrogenin A (DDA)，一种在正常乳腺组织中的肿瘤抑制因子。在阿尔茨海默病患者的额叶和枕叶皮层中观察到5,6α-EC水平升高。迄今为止，对其异构体5,6β-EC的具体功能知之甚少。虽然5,6-EC的两种非对映异构体都不被归类为强效致癌物，但它们在哺乳动物细胞中的代谢与癌症进展有关。相反，5,6-EC也表现出对抗人多发性骨髓瘤细胞的生物活性特性。24S-OHC是大脑中主要的胆固醇代谢物，通过主要在神经元中表达的CYP46A1酶合成。24S-OHC的循环水平取决于大脑生产和肝脏清除，使其成为脑胆固醇代谢的重要标志物。其异构体24(R)-OHC尚未在自然界中被识别。其另一个异构体27-OHC参与从外周组织到肝脏的固醇运输，并作为胆汁酸合成的底物。27-OHC的异常水平通过免疫调节与动脉粥样硬化、肿瘤进展和乳腺癌转移以及神经系统疾病有关。
分离结构异构体如7α-/7β-OHC、5,6α-/EC和24(R/S)-、25-和27-OHC仍然是一个重大的分析挑战，因为它们在多反应监测（MRM）模式下具有相同的分子量和相似的碎片模式。已经开发了许多分析方法用于不同氧固醇组的准确定量。其中，衍生化气相色谱（GC）已被广泛使用。然而，衍生化增加了样品制备的复杂性和时间。因此，开发使用广泛可用的反相液相色谱（RPLC）的无衍生化方法具有相当大的兴趣，因为它可以提高效率和可及性。使用GC、正相HPLC和手性分离以及反相HPLC（包括Alltima 5-μm C18和Dynamax 8-μm C8柱在各种溶剂系统中）已经证明了32种氧固醇的全面色谱行为。此外，使用各种RPLC柱（如Restek Raptor Inert Biphenyl、改性C18 L-column2 ODS和Phenomenex Gemini C18）已经报道了不同氧固醇组的分离。尽管有这些尝试，以前的方法通常仅限于分离具有不同MRM过渡的氧固醇，或者最多解析一对异构体。同时分离最具结构挑战性的异构体——如7α-/7β-OHC、5,6α-/5,6β-EC和24(R/S)-、25-和27-OHC——尚未实现。
在本研究中，我们旨在分离结构相似的氧固醇异构体，这些异构体在低温度下的RPLC-质谱分析中提出了重大挑战，以实现更好的分离并减少胆固醇在Acquity UPLC BEH C18或C8柱上自动氧化为氧固醇。在选择的八种氧固醇中，七种共享相同的MRM过渡（m/z 385.4→367.5），使它们的识别和定量复杂化。大多数氧固醇离子被检测为[M-H2O+H]+，表明从其分子量中失去一个水分子。值得注意的是，异构体对如7α-/7β-OHC、5,6α-/EC和侧链氧化物种，包括24R-、24S-、25-和27-OHC，使用标准RPLC方法特别难以解析。我们在此证明，尽管共享MRM过渡，这些挑战性异构体的基线分离可以通过优化的RPLC-MS条件实现。该方法开发能够更准确和自信地识别和定量复杂生物样品中的氧固醇。
2.1 Chemicals and Reagents
Optima LC-MS级乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、水和甲酸购自Fisher Scientific。胆固醇、7α-羟基胆固醇、7β-OHC、7-KC、5,6α-环氧胆固醇、5,6β-EC、24R-羟基胆固醇、24S-羟基胆固醇和25-OHC购自Cayman Chemicals；27-OHC购自Enzo Life Sciences Inc.。
同位素标记的内标（IS），包括胆固醇的d7形式、5,6α-环氧胆固醇、5,6β-EC、22(S)-羟基胆固醇和27-OHC的d6形式，购自Avanti Research。7α-羟基胆固醇、7β-OHC、7-KC、24R,S-羟基胆固醇的d7形式和25羟基胆固醇的d6形式购自CDN Isotopes；24羟基胆固醇-d4购自LGC Standards Ltd.。
2.2 Normal Diet-Fed Mice and High-Fat Diet-Fed Mice
C3H/HeJ (C3H) 小鼠品系作为研究肥胖发展的替代模型，特别是在非易感人群中随时间推移的情况。动物处理遵循德克萨斯理工大学IACUC协议号19021-02的批准规定。总共64只雌性C3H小鼠在4周大时从Jackson Laboratories获得，并允许1周适应。小鼠每笼四只，在受控温度和湿度以及12小时光/暗循环的房间中饲养。一半的小鼠然后给予高脂酪蛋白（HFC）饮食（46% kcal脂肪），其余给予参考（CC）饮食（11% kcal脂肪），长达18个月。在研究期间随意提供饮食和水。每周称重小鼠并进行健康评估。在6、12和18个月的横断面时间点，从每个饮食组中牺牲三只小鼠，通过CO2安乐死随后颈椎脱位。完整的饮食配方可以在Barr和Gollahon中找到，以及表明HFC饮食组在研究过程中发展出饮食诱导肥胖（DIO）的发现。从每个饮食组和三个时间点总共18只小鼠用于评估其大脑和肝脏中的氧固醇异构体。
2.3 Chromatographic Conditions
本研究中使用的液相色谱系统是Shimadzu CBM-20A Nexera X2系列LC系统，配备脱气机（DGU-20A）、两个二元泵（LC-30AD）、自动进样器（SIL-30AC）和柱温箱（CTO-30A）。自动进样器保持在10°C。通过修改柱类型、流动相、温度和分离梯度来评估各种色谱条件，以优化氧固醇的分离。
当使用150 mm C18柱（Acquity Premier Vanguard FIT BEH 1.7 μm, 150 × 2.1 mm C18）时，探索了两种流动相系统：ACN/水系统和MeOH/水系统。ACN/水流动相系统由流动相A（MPA, 0.1%甲酸水溶液）和流动相B（MPB, 0.1%甲酸乙腈溶液）组成。色谱流速设置为0.4 mL/min。梯度洗脱程序开始时MPB为75%持续2分钟，然后在15分钟时达到98% MPB并保持到23分钟，然后在23.1分钟时返回75% MPB直到运行结束于25分钟；MeOH/水流动相系统由MPA（0.1%甲酸水溶液）和MPB（0.1%甲酸甲醇溶液）组成。色谱流速设置为0.3 mL/min。梯度洗脱程序开始时MPB为75%持续2分钟，在22分钟时达到98% MPB，并保持到30分钟。然后在30.1分钟时返回75% MPB并保持到色谱运行结束于33分钟。
当使用100 mm C8柱（Acquity UPLC BEH C8 1.7 μm, 100 × 2.1 mm柱来自Waters）时，使用与C18柱描述的相同流动相系统组件。在两种流动相系统中，梯度洗脱程序开始时MPB为70%持续0.5分钟，在8.5分钟时达到80% MPB，在9分钟时达到98% MPB并保持到10.5分钟，然后在10.6分钟时返回70% MPB并保持到结束于12分钟。色谱流速设置为0.4 mL/min。
在所有实验中注入10 μL氧固醇样品和5 μL胆固醇样品。评估了25°C、40°C和55°C的柱温。
2.4 Mass Spectrometry Conditions
质谱系统由SCIEX QTRAP 6500+质谱仪组成，配备Turboionspray电离源。定量质谱条件配备正离子电喷雾电离在MS/MS检测中。气体参数包括雾化气50 psi、辅助气60 psi、气帘气45 psi和CAD气设置为中等。源的离子喷雾电压设置为5500 V，温度设置为550°C。化合物特定参数列于表S1。离子的检测在MRM模式下进行。获得的分析数据由Analyst软件（版本1.7.3）处理。
2.5 Sample Preparation for Mass Spectrometry Analysis
肝脏和脑组织在Pierce IP裂解缓冲液中裂解，补充蛋白酶抑制剂（每10 mL缓冲液一片Roche鸡尾酒片）和丁基化羟基甲苯（5 mg/mL）在DMSO中，组织与缓冲液比例为100 mg: 500 μL。使用机械探针在2.0 mL圆底离心管中以10,000 rpm均质30秒。
胆固醇和氧固醇主要储备液在氯仿中制备，浓度为1 mg/mL，储存于-80°C。所有工作储备液和进一步稀释也在MeOH中制备，储存于-20°C并在15天内使用。同位素标记的IS储备液以类似方式制备和处理。校准曲线标准品以及质量控制（QC）标准品在MeOH中制备，含0.1%甲酸，每种氧固醇浓度为1、5、10、50、100、250、500和1000 ng/mL，胆固醇使用0.1、0.5、1、5、10、25、50和100 μg/mL。低质量控制（LQC）标准品、中质量控制（MQC）标准品和高质量控制（HQC）的浓度制备为每种氧固醇15、150和600 ng/mL，胆固醇制备为1.5、15和150 μg/mL。
每个85 μL CC/QC样品或85 μL组织匀浆加入10 μL IS混合物（每种标记氧固醇500 ng/mL d7/d6，胆固醇d7为50 μg/mL）和5 μL BHT（100 mg/mL在DMSO中）。然后加入100 μL LC-MS级MeOH和200 μL二氯甲烷（DCM），并在台式涡旋混合器上彻底混合1分钟。向混合物中加入100 μL LC-MS级水并涡旋10秒，然后将玻璃管在室温下保持15分钟进行相分离。然后样品在4000 × g，4°C下离心10分钟。最后，收集170 μL下层DCM层并在速度真空下干燥，并重新溶解在100 μL MeOH中，加入0.1%甲酸以重新溶解提取物用于LC-MS分析。
2.6 Computational Methods
计算模拟氧固醇的相对保留时间（RT）以预测的己烷:水分配系数logPhw表示。计算结合了构象搜索和密度泛函理论（DFT）精修稳定结构。构象搜索使用CREST metadynamics和分子动力学算法自动探索构象空间，结合GFN2-xTB紧束缚哈密顿量以及己烷和水的GBSA连续溶剂模型。对于每个分子，我们进行两次CREST构象分析，一次在水中，一次在己烷中。三个最低能量结构使用Gaussian 16包中的DFT计算进行精修，采用ωB97X-D色散校正DFT泛函、def2tzvp基组、己烷和水的SMD连续模型以及ωB97X-D/6-31G(d)几何结构和振动频率。吉布斯自由能取为在连续溶剂中计算的自由粒子刚性转子谐波振荡器（RRHO）自由能校正。
3.1 Chromatography Optimization
3.1.1 Selectivity of C18 Versus C8 Columns
反相高效液相色谱（RP-HPLC）依赖于疏水固定相，通常由烷基链组成。C18柱具有更长的链，表现出比C8柱更大的疏水性，这可以影响分离效率和选择性。虽然分析物通常按疏水性增加顺序洗脱，但氧固醇异构体在C18和C8柱之间经常表现出意想不到的选择性差异。
在我们的实验中，我们观察到异构体对在C8和C18柱上的选择性不同，特别是对于7α-/7β-OHC和5,6α-/5,6β-EC。无论使用流动相ACN或MeOH，7α-/7β-OHC对在C18柱上共洗脱，在C8柱上实现基线分离。有趣的是，这些异构体的洗脱顺序相反：7β在C8柱上先洗脱，而7α在C18柱上先洗脱。相反，5,6α-/5,6β-EC对在C18柱上显示改善的分离，但在C8柱上仍未解析。DFT预测的己烷:水分配系数（logPHW）对于7α-OHC比7β-OHC正0.52 log单位，对于5,6β-EC比5,6α-EC正0.04 log单位，与7α和5,6β偏好流动相并在C18柱上先洗脱一致。对于其余四种氧固醇-24R-OHC、24S-OHC、25-OHC和27-OHC，当使用ACN作为流动相时，C18柱表现出更高的分离效率。当使用MeOH时，C8柱提供略好的分辨率。总体而言，分离效率受柱类型、流动相组成和柱温度的组合因素影响。
柱分离温度对保留、选择性和柱效率有很大影响，并且长期以来一直被接受为液相色谱（LC）中的重要参数。尽管有这个事实，温度优化在过去并没有非常积极地使用。温度对分析物保留和选择性的影响因每种分析物而异，并取决于流动相和固定相的性质。7α-OHC和7β-OHC的相对RT对柱温度高度敏感。我们的结果表明它们的分离在较低柱温度下改善。类似地，降低的温度增强了5,6α-和5,6β-EC（5,6α-/5,6β-EC）的分辨率，特别是在C18柱上。25-OHC、27-OHC和24(R)/(S)-OHC的分离在反相柱上提出了重大的色谱挑战。较低柱温度改善了ACN系统中25-OHC与其他氧固醇的分离。同样，降低的温度略微增强了MeOH系统中27-OHC的分离。然而，在所有测试条件下，24S-和27-OHC在ACN流动相中仍未解析，而24S-和25-OHC在MeOH系统中无法分离。计算表明不同分析物的差异氢键可能有助于观察到的柱分离温度对选择性的影响。7α-OHC中的羟基是轴向的并且空间受阻，而7β-OHC中的羟基是赤道位的且较少受阻。5,6β-EC中的环氧基被附近的甲基空间阻碍，而5,6α-EC中的环氧基较少受阻。较少受阻的物种7β-OHC和5,6α-EC更可用于与流动相形成氢键。同样，伯醇27-OHC比叔醇25-OHC更具氢键性。降低柱温度增加了与流动相的氢键强度， presumably improving the resolution of isomers possessing small differences in hydrogen bonding. 与这一假设一致， resolving the secondary alcohols 24(R)/(S)-OHC from the tertiary and primary alcohols 25-OHC and 27-OHC remains challenging even at low temperature. 总体RT和固定相与流动相之间的分配取决于许多因素；然而，氢键位点的空间可及性提供了对温度依赖性选择性的特定机制贡献。
3.1.3 Solvent System Selectivity
ACN和MeOH是RPLC中最常用的有机溶剂，但它们不同的极性可能导致相同分析物的不同分离模式。主要因素是溶剂的“洗脱强度”，它描述了其从固定相中去除分析物的能力；较强的溶剂将以相同的浓度更快地洗脱分析物。ACN通常被认为比MeOH更强的洗脱溶剂，意味着它以相同的浓度更快地洗脱分析物。溶剂系统对固醇环氧化胆固醇7α-/7β-OHC和5,6α-/5,6β-EC异构体对的分离影响相对较小，MeOH为两个对提供略好的分辨率 compared to ACN。相反，侧链氧化胆固醇24R-OHC、24S-OHC、25-OHC和27-OHC的分离被发现是溶剂依赖的。当使用ACN作为流动相时，洗脱顺序为25-OHC、24S-/27-OHC（未解析）和24R-OHC，C18柱提供比C8更好的分辨率。然而，当使用MeOH时，洗脱顺序变为24S-/25-OHC（未解析）、24R-OHC和27-OHC在两个柱上。
总体而言，较低的柱温25°C为我们研究的大多数氧固醇提供了更好的分离。在此柱温下，我们在ACN基流动相中的C8柱上实现了7α-和7β-OHC的最佳分离。异构环氧胆固醇5,6α-和5,6β-EC在此温度下在C18柱上使用MeOH或ACN作为流动相非常 well resolved。24R-OHC、24S-OHC、25-OHC和27-OHC的分离在两种条件下在较低柱温25°C下是最佳的：C18与ACN和C8与MeOH。然而，尽管各种优化努力，一些分析物无法完全解析，如24S-OHC和27-OHC。幸运的是，它们可以通过独特的MRM过渡（385.4 > 367.5 for 24S-OHC and 385.4 > 161.3 for 27-OHC）进行区分，从而实现准确的个体定量。相反，24S-OHC和25-OHC在MeOH中难以分离并共享相同的MRM过渡，使它们在采用MeOH作为流动相时的独立定量更具挑战性。有趣的是，24R-OHC和27-OHC在C8柱上比在C18上更好地分离，强调了固定相选择在氧固醇分析中的重要性。
总之，这些发现突出了优化柱选择性、柱温和流动相组成在使用反相HPLC实现氧固醇异构体可靠分离中的关键作用。这种优化对于生物样品中的准确定量至关重要。
3.2 Oxysterol Levels in Brains of Reference-Diet and High-Fat Diet Mice
C3H小鼠品系是研究长期慢性年龄相关、DIO模型中肥胖的稳健模型。该品系为研究西方社会日益增长的肥胖流行病提供了一个有价值的替代模型，特别是在非遗传易感肥胖的人群中。作为长寿模型，它还提供了对饮食诱导的生活方式因素导致肥胖和衰老因素的独特见解，这些因素在转基因或肥胖易感品系中经常被忽视。此外，该小鼠模型为检查饮食和DIO对衰老的影响建立了坚实的基础，特别是在大脑中。它还使得探索肥胖和糖尿病如何增加神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的风险成为可能。
在Barr和Gollahon的研究中，64只雌性C3H小鼠分为两组（n = 32），并维持控制饮食或高脂饮食（HFD）长达18个月。每6个月，选择一个横断面队列（n = 8）进行评估。监测小鼠总体重、瘦体重、脂肪量、存活率和肿瘤发生率的变化。C3H品系发展出DIO，在HFD喂养的小鼠中观察到总质量增加。然而，雌性小鼠显示出大约40%的存活率， regardless of diet。在本研究中，从每个年龄和饮食组中选择三个雌性小鼠重复样本来评估肝脏和脑组织中的胆固醇和氧固醇水平。
基于我们优化的LC-MS方法测量，在低柱温25°C下实现所有八种氧固醇异构体的最佳分离，肝脏和大脑中的胆固醇水平在不同年龄和饮食组之间保持相对一致，显示 small variations。然而，大脑中检测到的胆固醇水平大约比肝脏高10倍。相反，7α-OHC、7β-OHC、7-KC和27-OHC的水平在脑和肝组织之间相当。在不同年龄和饮食组中观察到 slight variations；然而，这些差异在统计上不显著。
24S-OHC，一种主要在大脑中产生的胆固醇代谢物，在脑组织中表现出显著更高的浓度（与肝脏相比高20-40倍）。其水平显示 approximately linear increase with age， independent of dietary influence。24S-OHC主要由神经元通过CYP46A1酶产生，这有助于调节大脑中的胆固醇稳态。与胆固醇不同，胆固醇不易穿过BBB，24S-OHC可以通过BBB退出大脑并进入循环进行肝脏代谢。大脑中24S-OHC随年龄增加可能主要 due to age-related changes in cholesterol metabolism。相反，肝脏中检测到的24S-OHC水平并未 clearly indicate any influence from age or diet。相反，它反映了其在大脑中的生产与其被肝脏清除的速率之间的平衡。
此外，大脑中5,6α-EC水平仅在 mice were on a high-fat diet时随年龄增长而下降。相反，在肝脏中，5,6α-EC水平仅在 high-fat diet时随年龄增长而增加，因此它受年龄和饮食因素的影响。
在低柱温25°C下，7α-和7β-OHC在使用ACN基流动相的C8和C18柱上实现了最佳分离，而5,6α-和5,6β-EC在使用ACN-或MeOH基流动相的C18上 well resolved。在此温度下，使用C18柱与ACN或使用C8柱与MeOH作为流动相，也观察到24R-OHC、24S-OHC、25-OHC和27-OHC的最佳分离。使用相同的低柱温25°C，我们使用C18柱和ACN作为流动相来量化控制和高脂饮食小鼠纵向研究中的胆固醇和八种氧固醇。24S-OHC在两个饮食组中与年龄显示 robust linear correlation，表明其作为成年小鼠衰老生物标志物的潜力。而5,6α-环氧胆固醇水平受年龄和饮食因素的影响，显示在高脂饮食小鼠中与年龄 inverse correlation。
后续基于当前示例的氧固醇色谱行为计算预测将扩展到更广泛的脂质，使用机器学习RT模型。这种方法有潜力推进跨各种色谱方法的 de novo RT预测，进而指导更有效的分离条件优化。
Indhumathy Subramaniyan: conceptualization, methodology, writing – review and editing. Benjamin Barr: resources, writing – review and editing. Ninh M. La-Beck: conceptualization, writing – review and editing. Benjamin G. Janesko: methodology, writing – review and editing. Lauren Gollahon: resources, conceptualization, writing – review and editing. Li: conceptualization, methodology, writing – original draft, writing – review and editing.
我们感谢Ronald Hall博士（临床药理学和实验治疗中心主任，临床和转化研究部门负责人）对稿件的批判性阅读。
