综述：光合作用过程中的二氧化碳释放：将气体交换行为与生物化学联系起来

本综述系统探讨了光合作用中CO2释放的机制，揭示了除光呼吸（Photorespiration）外，光下呼吸（RL或Rd）是CO2排放的重要独立来源。作者通过同位素标记（如13CO2）和代谢通量分析（MFA）技术，证实胞质葡萄糖-6-磷酸（G6P）经由氧化戊糖磷酸途径（OPPP）的分流是RL的主要贡献者。这一发现解释了卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环标记中的长期异常现象，并表明RL在非胁迫条件下对不同CO2浓度和光强保持稳定，而在热胁迫下则转向质体来源。该研究深化了对光合碳平衡的理解，为改进气体交换测量模型提供了关键生化依据。

　　

1 引言与历史

在C₃植物叶片进行光合作用吸收CO₂的同时，存在着CO₂释放的过程，Otto Warburg曾将这一现象称为精确测量光合作用的“噩梦”。过去50年间，研究已将气体交换行为与光合作用的底层生物化学联系起来。现在我们知道，这种CO₂的反向流动大部分被理解是光呼吸（Photorespiration）所致，其会导致光照后的CO₂爆发（Post-illumination Burst）。该爆发实际上由几个过程组成，包括光照后CO₂的固定以及甘氨酸脱羧等。

光呼吸的第一步由Bowes等人（1971）和Ogren与Bowes（1971）确定，他们证明光呼吸源于Rubisco对核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）的加氧反应，而非羧化反应。随后对拟南芥突变体的分析确认了光呼吸中的关键步骤，凸显了拟南芥作为植物代谢研究强大工具的价值。

2 光呼吸对气体交换行为的影响

认识到光合作用期间存在一个或多个CO₂释放来源，导致了“总光合作用”或“真实光合作用”与“净光合作用”的术语区分。如今更常见的说法是羧化速率（v_c）和净光合作用（A）。光呼吸由加氧速率（v_o）表示，并通过三种方式影响气体交换行为：1. 通过甘氨酸脱羧释放CO₂；2. 光呼吸代谢消耗了本可用于碳同化的能量；3. 通过作为羧化作用的竞争性抑制剂而降低Rubisco的效率。

光呼吸像动物呼吸一样涉及氧气吸收和CO₂释放，但它消耗能量而不是产生能量，尽管如此它仍被称为光呼吸（Photorespiration）。

一旦了解到Rubisco的加氧作用，就可以对其进行建模，以将生化理解与气体交换行为进行比较。Laing等人（1974）发布了一个方程，其中A（他们使用P_n表示净光合作用）是CO₂吸收的净速率，t是每次加氧事件损失的CO₂分子数。最初t被取为0.25，但随着对乙醇酸代谢的理解加深（Tolbert 1971），Keck和Ogren（1976）将其改为0.5。换句话说，每两次加氧事件就会释放一个CO₂。

Farquhar等人（1980）在发表关于C₃叶片气体交换行为与底层代谢之间关系的论文时，允许存在其他释放CO₂的反应。这通常被认为是残留的三羧酸（TCA）循环活性，被称为光下暗呼吸（R_d）。他们也确定t为0.5。因此，到1980年，方程变为：A = v_c - 0.5 v_o - R_d。这个方程是许多光合作用模型的起点，并将气体交换行为与生物化学联系起来。

Farquhar等人（1980）的一个重要贡献是认识到Rubisco与其底物RuBP的相互作用遵循紧结合抑制剂（或紧结合底物）的动力学（Morrison 1969; Farquhar 1979）。在生物学中，我们通常认为控制分散在整个系统中，但在Rubisco和RuBP再生的案例中，这是一个非此即彼的情况。气体交换将反映要么是RuBP饱和的动力学（Rubisco限制），要么是RuBP限制的动力学（J限制）。熟悉的米氏动力学（Michaelis Menton kinetics）仅适用于底物结合亲和力远大于结合位点浓度的情况（Sharkey 2023）。

3 输入与输出

方程A = v_c - 0.5 v_o - R_d假设光合碳代谢仅取决于输入；CBB循环的输出被认为具有无限能力。Sharkey（1985）提出，在非常高的光合速率下，利用光合代谢产物的能力可能会限制A，这被称为磷酸丙糖利用（TPU）限制。当光合作用受最终产物利用限制时，减少光呼吸会减少最终产物之一，从而降低A；光合作用表现出对CO₂和O₂的反向敏感性（Harley和Sharkey 1991）。

Yin等人（2021）和Busch等人（2018）的研究进一步改善了我们对光合碳代谢的理解。Busch等人（2018）引入了两个新参数：α_G（进入光呼吸但以甘氨酸形式离开的碳比例）和α_S（以丝氨酸形式离开的碳量）。这些参数对气体交换行为有不同的影响。方程因此变为：A = v_c - (0.5 + 0.5 α_S - α_G) v_o - R_d。

当光合作用受最终产物形成限制时，TPU限制下的光合速率A_T可以建模。这个方程预测了当光合作用受TPU限制时，光合作用对CO₂的响应。

4 光下呼吸（R_L）

虽然在理解光呼吸及其对气体交换行为的影响方面取得了显著进展，但关于参数R_L或R_d的报道较少。Farquhar等人（1980）最初称之为“光下暗呼吸”，并假设其起源于线粒体。von Caemmerer和Farquhar（1981）称该参数为“日呼吸（day respiration）”——除光呼吸途径外释放的CO₂。称之为日呼吸允许方程中的表示保持不变，但由于它不是依赖于白天而是依赖于光，我们使用R_L——在光下除光呼吸途径外释放的CO₂。通常，R_L低于黑暗中的呼吸作用（Gong等人2018）。

测量R_L是困难的（Yin和Amthor 2024）。方法包括在极低光下测量光响应[Kok方法及其后继者Yin方法（Schmiege等人2024）]或在低CO₂下测量[Laisk方法（Schmiege等人2024）]。两种方法都在低光合速率下测量，通常低于补偿点。基于同位素非平衡的方法也有报道（Gong等人2018）。这些方法的优点是可以在生理光合速率下进行。同位素方法可用于估算森林中的R_L（Heskel和Tang 2018）。

5 R_L中碳损失的起源

R_L的起源一直是许多推测的主题[Tcherkez等人（2017）综述]。当叶片被喂食¹³CO₂时，TCA循环中间体的标记总是低于5%，有时远低于此（Calvin和Massini 1952; Szecowka等人2013; Ma等人2014; Xu等人2022; Fu等人2023）。然而，从拟合气体交换数据可以清楚地看出，释放的CO₂比光呼吸所能解释的要多。必须有一个或多个额外的CO₂释放来源，其强度足以影响气体交换行为，但这些碳几乎都不是来自TCA循环反应。

有许多在光下可能活跃的释放CO₂的过程（Tcherkez等人2017; Yin和Amthor 2024）。这些包括脂肪酸合成（通过丙酮酸脱羧释放CO₂），以及用于类异戊二烯合成的甲基赤藓醇4-磷酸途径（通过1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶释放CO₂）。另一个可能导致光下碳损失的过程是氧化戊糖磷酸途径（OPPP），无论是在叶绿体内部还是外部。

我们提出，植物细胞胞质中的OPPP是被认为是R_L的CO₂流出的主要原因。OPP途径涉及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH），它氧化G6P。最终产生CO₂、两个NADPH和核酮糖5-磷酸（Ru5P）。在我们的方案中，Ru5P通过木酮糖5-磷酸/磷酸转运蛋白重新进入叶绿体，绕过部分CBB循环并为胞质中的生物合成反应提供NADPH。

6 由OPP途径解释的气体交换异常

卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环是光合碳同化的核心。最近使用¹³C标记的研究发现了CBB中间体标记模式的异常，促使对底层代谢过程进行进一步检查。

6.1 CBB中间体缺乏完全标记

¹³C标记研究中一个更令人困惑的观察是CBB循环中间体的不完全标记。虽然CBB循环中间体在几分钟内标记到80%–90%的¹³C，但剩余的10%–20%的标记以慢得多的速率发生（Mahon等人1974; Hasunuma等人2010; N?gele等人2010; Szecowka等人2013; Ma等人2014）。早期研究假设存在代谢非活性库来解释这个慢标记阶段（Hasunuma等人2010; Szecowka等人2013; Ma等人2014）。

然而，缺乏这种库的生物化学证据。另一种解释是未标记的碳可以从胞质，通过胞质OPP途径，进入叶绿体。最近的MFA研究为这一假设提供了支持（Xu等人2022）。这可以建模为假设有两个输入进入一个共同的碳库。

基于其他证据，我们假设F₂是来自胞质OPPP的碳流，因此乘以5以解释作为Xu5P进入叶绿体的五个碳，按其未标记碳含量比例稀释¹³C标记。该方程用于构建图表，显示合理的通量值（R_L，红色框）和标记值（橙色框）在假定相对未标记碳输入CBB循环的非常合理的值处重叠。

叶绿体基质中的葡萄糖-6-磷酸（G6P）通过测量源自基质G6P的ADP-葡萄糖来确定，其¹³C高度富集（Xu, Koroma,等人2024）。ADP葡萄糖（叶绿体报告分子）和UDP葡萄糖（胞质报告分子）的标记证实氧化戊糖磷酸途径通量通常完全是胞质的（Xu等人2022）。基质OPP途径不能解释缺乏完全标记的原因，因为基质中的G6P不会被¹³CO₂耗尽。胞质OPP途径可以轻易解释CBB循环中间体缺乏完全标记的原因。

6.2 完全未标记分子的过量存在

另一个有趣的观察是，即使在代谢物的平均标记度为70%至90%时，CBB中间体中完全未标记分子（M+0同位素异数体）的过量存在（Hasunuma等人2010; Sharkey等人2020）。与M+1相比，M+0的丰度明显更高，这表明存在一个包含五个共价键结合在一起且完全未标记的碳源。

Sharkey等人（2020）提出，这是由显著未标记的自由葡萄糖通过胞质OPP途径的碳流造成的。这使得G6P分流绕过了CBB循环的非氧化戊糖磷酸途径反应。完全未标记的分子遵循OPP途径，然后通过木酮糖5-磷酸/磷酸转运蛋白进入叶绿体（Eicks等人2002; Hilgers等人2018），并可能通过其他可以运输戊糖磷酸的转运蛋白。

以羧化速率2%的速率流入完全未标记的戊糖磷酸会将最大标记限制在90%，从而解释了存在比预期更多的M+0离子（Allen和Young 2020）。通过测试具有不同未标记碳源的多个MFA模型，Xu等人（2022）发现M+0同位素异数体的过量存在最好由胞质和液泡糖的缓慢周转来解释，这些糖随着时间的推移缓慢地将未标记的葡萄糖和果糖通过G6P分流送入CBB循环。

6.3 CBB中间体标记动力学的三个阶段

先前的研究表明，CBB循环中间体表现出快速的初始标记，随后是向完全标记的较慢进展（Hasunuma等人2010; N?gele等人2010; Szecowka等人2013; Ma等人2014）。Xu等人（2022）进一步表明，将标记时间延长至2小时，揭示了CBB循环中间体标记动力学中三个不同的阶段——快速、中期和慢速——每个阶段匹配不同的代谢过程。

使用三指数模型，Xu等人（2022）假设这些阶段是：1. 由于传入的¹³CO₂的固定而快速标记；2. 由于通过G6P分流重新进入CBB循环的胞质葡萄糖的弱标记碳的稀释而标记较慢；3. 由于液泡糖的未标记碳的进一步稀释而标记非常慢（Xu等人2021）。ADPG与CBB循环中间体标记相同的事实排除了淀粉或其他质体库作为未标记碳来源的可能性。

该模型得到非线性回归和统计模型选择标准的支持，消除了援引代谢非活性库的需要，并提供了对光合细胞中碳流的更全面理解（Uys等人2007; Xu等人2021）。将胞质和液泡糖库纳入CBB循环的代谢网络，消除了对代谢非活性库的需要，并解释了¹³C标记的 prolonged 稀释，因为这些库充当未标记碳的储存库，缓慢地重新进入CBB循环。

7 光下呼吸（R_L）的主要来源

使用¹³CO₂同位素标记和同位素非稳态代谢通量分析（INST-MFA），Xu等人（2021）提出胞质G6P分流占作为R_L释放的CO₂的93%以上。为了测试替代观点，作者强制MFA模型将R_L归因于TCA循环、脂肪酸合成或基质G6P分流中的潜在来源。当R_L被强制由TCA循环解释时，残差平方和（SSR，拟合优度的度量）增加了53%以上，表明对实验性¹³C标记数据的拟合不佳。强制R_L由脂肪酸合成解释也导致更差的拟合，SSR与无约束模型相比增加。

TCA循环对R_L的微小贡献可能是由于TCA循环中间体在数小时内表现出最小的标记（<5%），这与拟南芥（Szecowka等人2013; Ma等人2014; Arrivault等人2017）、亚麻荠（Xu等人2021; Xu等人2022）和烟草（Fu等人2023）中的¹³CO₂同位素标记研究一致。

Xu, Schmiege,等人（2024）在亚麻荠叶片中使用氘标记，发现TCA循环中间体库在24小时内表现出显著缓慢的周转。这种低标记可能源于大的、缓慢周转的液泡有机酸库， combined with 光合作用期间通过这些TCA中间体的活性胞质和线粒体库的通量有限。这些发现与先前关于TCA循环酶活性对维持最佳光合速率重要性的观察并不冲突，而是表明这些途径的绝对通量太低，无法解释R_L。

8 胞质G6P分流在R_L中的主导地位

G6P分流在胞质和质体区室中都起作用，尽管具有不同的活动模式。胞质G6P分流以相对稳定的速率持续运行，如呼吸损失测量所示（Tcherkez等人2017; Schmiege等人2023）。相比之下，基质G6P分流在正常日光条件下大多保持非活性，这是由于硫氧还蛋白介导的基质G6PD的氧化还原控制（Wenderoth等人1997; Hauschild和von Schaewen 2003），以及其产物NADPH的抑制（Wakao和Benning 2005; Preiser等人2019）。胞质G6PDH的调控要少得多（Kruger和von Schaewen 2003; Wakao和Benning 2005），允许它们在光下保持活性。

R_L主要由胞质过程驱动，如同位素标记研究所示。Sharkey等人（2020）在杨树叶片中使用¹³CO₂标记表明，6-磷酸葡萄糖酸（6PG），OPP途径中的一种中间体，与尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）（胞质G6P的标志物）的标记非常匹配，当叶片保持在30°C时。相比之下，腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）（反映基质G6P）显示出显著更高的标记，表明在正常条件下基质分流活性极小。Xu, Schmiege,等人（2024）在烟草中使用¹³CO₂标记发现，6PG标记与UDPG密切匹配，但低于ADPG。这种模式在低、环境和