基于IR-MALDESI的体素级单点校准定量质谱成像新方法及其在肝组织谷胱甘肽分析中的应用

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Demonstrating voxel-by-voxel (V?×?V) single-point calibration in liver tissue by IR-MALDESI quantitative MSI

本研究针对传统qMSI空间校准曲线制备繁琐、无法校正局部基质效应的问题，开发了体素级单点校准(VxV)新方法。研究人员通过均匀喷涂稳定同位素标记谷胱甘肽(SIL-GSH)作为内标，结合IR-MALDESI技术成功实现了小鼠肝组织内谷胱甘肽的精准定量分析。该方法不仅简化了样品前处理流程，还能有效克服组织异质性带来的定量偏差，为生物标志物的空间分布研究提供了新技术支撑。

　　

在生物医学研究领域，精确了解分子在组织中的空间分布至关重要。质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）技术能够在保持组织空间结构的同时，可视化成百上千种分子的分布情况，成为生命科学研究中的强大工具。然而，传统的定量质谱成像（quantitative MSI, qMSI）方法存在明显局限性——最常用的空间校准曲线方法需要繁琐的样品制备过程，且在组织异质性区域无法准确校正局部基质效应，这严重限制了其在复杂生物样品中的应用。

为了解决这些挑战，北卡罗来纳州立大学David C. Muddiman团队在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上发表了创新性研究成果，开发了一种名为“体素级单点校准”（voxel-by-voxel single-point calibration, VxV）的新方法。该研究以小鼠肝组织中的谷胱甘肽（glutathione, GSH）为分析目标，系统评估了VxV定量方法的性能，并与传统空间校准曲线方法进行了比较。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先利用红外矩阵辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）这一混合电离技术，结合衍射光学元件实现方形消融点的顶帽成像；其次开发了新型样品制备流程，通过均匀喷涂稳定同位素标记的谷胱甘肽（SIL-GSH）作为内标；此外还建立了专门的MSiReader Pro v3.07软件分析工具，能够生成浓度热图并实现平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring, PRM）成像。实验使用了健康野生型新鲜冷冻小鼠肝组织样本，所有动物实验均获得北卡罗来纳州立大学动物护理和使用委员会的批准。

定量结果通过标准化标准品得到改善

研究人员系统比较了三种数据标准化方法：未标准化数据、总离子流（TIC）标准化和同型谷胱甘肽（homoglutathione, hGSH）标准化。结果表明，使用hGSH作为标准化标准品能显著降低体素间的变异性，使计算出的浓度值更接近文献报道值。统计分析显示，hGSH标准化数据与未标准化数据之间存在极显著差异（p值分别为4.41×10^-13和9.79×10^-13），凸显了在qMSI实验中使用标准化标准品的重要性。

小鼠肝组织中谷胱甘肽的定量

对于空间校准曲线方法，研究人员在肝组织上点样了SIL-GSH的系列稀释溶液（0-1.00 mg mL^-1），构建了校准曲线。两个肝组织 replicates 的平均内源性谷胱甘肽浓度分别为3485.96 μg/g和3468.97 μg/g，无显著差异（p=0.604）。而VxV定量方法则通过均匀喷涂1.0 mg mL^-1的SIL-GSH溶液到载玻片上，然后 thaw-mounting 肝组织切片。使用MSi VxV定量工具生成的浓度热图显示，两个 replicates 的平均浓度分别为8553.54 μg/g和8386.56 μg/g。VxV方法得到的浓度较高，主要原因是喷雾器的设计导致沉积体积不准确，限制了方法的准确性。

平行反应监测定量质谱成像

研究人员优化了PRM实验参数，选择m/z 307.8784作为前体离子（内源性GSH和SIL-GSH的平均值），隔离宽度为4 m/z，最佳归一化碰撞能量为20%。通过分析谷胱甘肽的碎片离子模式，选择m/z 272.0888（由完整分子失去H₂S形成）作为定量离子。PRM-qMSI应用显示，使用完整分子和定量离子生成的浓度热图具有相似性，提高了分析物选择性的可信度。

统计分析

为了评估VxV定量的变异性，研究人员进行了两项实验：一是制备NAT-GSH和SIL-GSH的2:1稀释系列溶液并喷涂到载玻片上；二是制备SIL-GSH稀释系列并喷涂后 mounting 肝组织切片。结果表明，信号强度与丰度比的方差存在明显关系：当SIL-GSH信号强度较低时方差较大，超过一定阈值（1.50×10⁴ions/s）后趋于稳定。此外，当两种分析物的比例接近1:1时，方差显著减小，强调了内标浓度应接近目标分析物浓度的重要性。

本研究证实了VxV定量方法在IR-MALDESI MSI中的可行性，该方法相比传统的on-tissue校准曲线具有明显优势，特别是在样品制备简便性和高特异性PRM-qMSI应用方面。统计分析表明VxV定量具有高精度，但方法的准确性受到标准品定量沉积问题的限制。未来工作将重点解决喷雾沉积的准确性问题，并将该方法应用于模型研究和临床前应用。这项技术为复杂生物组织中生物标志物的精准空间定量分析开辟了新途径，有望在疾病机制研究和药物开发中发挥重要作用。