PG50株粘附侵袭力显著减弱：Leachii支原体与牛支原体致病机制差异揭示

《Veterinary Research Communications》：Mycoplasma leachii strain PG50 shows reduced adherence and invasion compared to M. bovis strains 428E and PG45

本研究针对Leachii支原体（Mycoplasma leachii）这一与牛乳腺炎、关节炎和流产相关但研究不足的病原体，通过比较其标准株PG50与牛支原体（Mycoplasma bovis）标准株PG45及野外株428E对多种牛源细胞（MDBK、BTu、CP5）的粘附和侵袭能力，发现PG50的粘附侵袭效率显著降低（降低1.5-2.9 log10CFU/mL），且此现象不受培养时间（2 h vs. 24 h）、细胞类型（上皮细胞/成纤维细胞）或BVDV-1b存在与否的影响，为评估其物种特异性致病潜力提供了关键依据。

　　

在奶牛养殖业中，支原体感染一直是引发牛群呼吸系统疾病、乳腺炎、关节炎和流产的重要原因，给畜牧业造成巨大经济损失。其中，牛支原体（Mycoplasma bovis）作为一种全球范围内流行的病原体，其致病机制已得到较多研究。然而，同属于“Mycoplasma mycoides cluster”的Leachii支原体（Mycoplasma leachii）虽然在澳大利亚、阿根廷和中国等地暴发过严重的奶牛乳腺炎、多发性关节炎和犊牛流产疫情，但由于其分布相对局限，科学界对其生物学特性和致病潜力的了解仍相当有限。尤其值得注意的是，该集群中还包含传染性牛胸膜肺炎（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides）和传染性山羊胸膜肺炎（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae）的病原体，这些都是具有重要经济影响的外来动物疾病。因此，厘清M. leachii与已知病原M. bovis在关键致病环节——宿主细胞粘附与侵袭方面的差异，对评估其跨境传播风险和完善相应防控策略具有突出意义。

为了回答上述问题，美国农业部农业研究服务局的研究团队开展了一项系统的体外比较研究。研究人员以M. leachii的标准株PG50为研究对象，将其与M. bovis的标准株PG45以及分离自爱荷华州病牛的野外株428E进行平行比较。研究选取了三种代表性的牛源细胞系：Madin-Darby牛肾细胞（MDBK，上皮来源）、牛鼻甲细胞（BTu，上皮来源）以及来自荷斯坦-弗里斯兰牛的关节软骨祖细胞CP5（呈成纤维细胞形态）。通过设定2小时和24小时两个时间点，并采用10至150的感染复数（MOI），研究人员精确量化了各支原体菌株在细胞上的粘附与侵袭总量（以CFU/mL计）。值得一提的是，实验中还发现所使用的胎牛血清（FBS）和CP5细胞本身污染了非致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒1b型（BVDV-1b），这意外地促使团队进一步增设了对照实验，以探讨BVDV共感染环境是否会影响支原体的粘附侵袭过程。所有实验均通过菌落形成单位（CFU）计数进行定量，并使用统计学方法对数据进行了严谨分析。

主要技术方法概述

本研究核心为体外细胞感染模型。使用MDBK、BTu（上皮细胞）和CP5（成纤维细胞）三种牛源细胞系，以10-150的感染复数（MOI）分别接种M. leachii PG50、M. bovis PG45和428E。通过2小时和24小时孵育后，经PBS洗涤和胰蛋白酶-EDTA处理，回收细胞相关细菌，通过系列稀释和PPLO琼脂平板点样计数CFU，以量化粘附和侵袭的总和。此外，通过RT-PCR和5‘UTR测序对细胞培养系统中意外发现的非致细胞病变型BVDV-1b进行了鉴定，并比较了BVDV阳性与阴性血清培养条件下支原体感染能力的差异。菌株在补充PPLO肉汤中的生长动力学通过定时取样进行CFU计数来评估。

粘附与侵袭MDBK、BTu和CP5细胞的能力差异

研究结果显示，在感染2小时后，M. leachii PG50对MDBK和BTu上皮细胞的粘附与侵袭量就显著低于两种M. bovis菌株（p < 0.0001）。

这一差异在CP5成纤维细胞中也同样存在（p < 0.0001），表明PG50的粘附侵袭能力较弱并非上皮细胞特异性现象。将感染时间延长至24小时后，M. leachii PG50在所有三种细胞系上的定植量依然显著低于M. bovis菌株（p < 0.0001）。这表明，与M. bovis相比，M. leachii PG50在体外模型中对牛源细胞的粘附与侵袭能力存在固有且持续的减弱，其降低幅度在1.5至2.9 log₁₀CFU/mL之间。

BVDV感染状态对粘附侵袭的影响

鉴于BVDV是细胞培养系统中常见的污染物，且可能改变宿主细胞的特性，研究人员特别比较了在BVDV阳性（非致细胞病变型BVDV-1b）和BVDV-free的胎牛血清培养条件下，支原体对MDBK和BTu细胞的感染情况。结果表明，无论是在2小时还是24小时，M. leachii PG50在BVDV-free条件下的粘附与侵袭能力依然显著低于M. bovis菌株（p < 0.001 和 p < 0.01）。统计分析确认，BVDV-1b的存在与否并未对M. leachii或M. bovis的粘附侵袭效率产生显著影响。这一发现与先前关于BVDV感染并不改变牛巨噬细胞对M. bovis摄取能力的研究结果相呼应。

细菌生长动力学分析

为了排除生长速度差异对实验结果造成的潜在偏倚，研究人员平行监测了三个菌株在补充PPLO肉汤中的生长曲线。有趣的是，生长评估显示M. leachii PG50的生长速率反而快于M. bovis菌株，其在培养24小时和28小时时的菌液浓度显著高于M. bovis（p < 0.05 和 p < 0.001）。PG50在24小时即达到约8.4×10⁸CFU/mL，并在28小时前突破1×10⁹CFU/mL，而M. bovis菌株直至52小时才达到同等浓度。因此，M. leachii PG50在细胞感染实验中表现出的低水平，并非由于其生长迟缓所致，反而凸显了其在粘附侵袭环节存在独立于生长能力的特定缺陷。

研究结论与意义

本研究的核心结论是，M. leachii的标准株PG50在体外条件下对多种牛源细胞（包括上皮细胞和成纤维细胞）的粘附与侵袭能力，均显著且稳定地低于引起相似疾病的M. bovis代表菌株。这一现象具有普遍性，不受感染时间、细胞类型或BVDV-1b共感染因素的影响。尽管M. leachii在浮游培养中生长更快，但这并未转化为更强的细胞关联能力，暗示其致病机制可能更少依赖于直接的细胞粘附与内化。

这一发现具有多重意义。首先，它从病原体-宿主相互作用的基础层面，揭示了M. leachii与M. bovis之间可能存在重要的毒力因子差异。粘附是许多支原体建立感染的关键初始步骤，PG50在此环节的能力减弱可能意味着其种内致病潜力或机制与M. bovis不同。这为理解同一菌簇内不同成员致病性的多样性提供了新的视角。其次，本研究首次系统评估了M. leachii的细胞感染特性，填补了对这一新发潜在病原体基础生物学特性认知的空白。尽管PG50的粘附侵袭能力较弱，但不能直接推断其临床致病性一定更弱，因为致病性是多重因素共同作用的结果，且先前对M. bovis的研究也发现粘附侵袭能力与临床疾病严重程度并非简单线性相关。最后，研究证实了常见的实验室污染物BVDV-1b（非致细胞病变型）的存在，并不干扰对这两种支原体粘附侵袭能力的评估，这为未来相关体外实验的变量控制提供了参考。

未来研究需要进一步阐明M. leachii毒力因子的具体特征，并与其近缘物种（如M. mycoides subsp. mycoides）进行更广泛的表型比较，特别是在巨噬细胞等免疫细胞中的存活能力，以全面评估其对动物健康的真实风险，为制定有效的监测和防控措施奠定科学基础。本研究由美国农业部资助，相关数据已公开，论文发表于《Veterinary Research Communications》。