连翘酯苷A通过NRF2/GPX4轴抑制铁死亡并改善2型糖尿病骨质疏松症的研究

本研究揭示了连翘酯苷A（FA）通过激活NRF2/GPX4信号通路抑制铁死亡（ferroptosis），有效改善2型糖尿病骨质疏松症（T2DOP）的分子机制。实验证实FA能促进NRF2核转位、上调GPX4表达、减轻氧化应激和线粒体损伤，并在体内外模型中显著恢复骨微结构和成骨分化功能，为T2DOP提供了潜在治疗策略。

　　

引言

全球老龄化加剧导致糖尿病发病率持续上升，2型糖尿病骨质疏松症（T2DOP）作为一种慢性骨代谢紊乱疾病，与高糖微环境密切相关，显著增加骨折和骨坏死风险。与传统绝经后骨质疏松不同，T2DOP患者骨小梁减少、间隙增宽，骨折风险增加32%，但目前缺乏有效药物治疗手段。铁死亡作为一种铁依赖性程序性细胞死亡方式，以细胞内铁离子积聚、活性氧（ROS）堆积和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活为特征，在糖尿病肾病、视网膜病变和心肌病等并发症中起关键作用。研究表明，骨髓间充质干细胞（BMSCs）的铁死亡是T2DOP的核心机制。核因子 erythroid 2-related factor 2（NRF2）作为抗氧化系统核心调控因子，可显著抑制铁死亡。连翘酯苷A（Forsythiaside A, FA）是从连翘果实中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和神经保护作用，近期研究发现其可通过激活NRF2抑制铁死亡，但其在T2DOP中的作用尚未明确。

材料与方法

FA（C₂₉H₃₆O₁₅，纯度99.43%）购自MedChemExpress。体外实验采用大鼠BMSCs，分为对照组、Erastin（铁死亡诱导剂）组和高糖高脂（HGHF，25.5 mM葡萄糖）组，并设置FA（5-80 μM）和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）干预组。通过CCK-8检测细胞毒性，EdU染色评估增殖，DHE和MitoSOX检测ROS，透射电镜观察线粒体形态，C11 BODIPY和FerroOrange分别检测脂质过氧化和Fe²⁺水平，Western blot分析ACSL4、GPX4、OPA1、DRP1、NRF2、Bcl-2、Bax等蛋白表达。体内实验采用SD大鼠T2DOP模型（高糖高脂饮食联合链脲佐菌素注射），分为假手术组、T2DOP组、T2DOP+FA（80 mg/kg）组和T2DOP+FA+ML385（NRF2抑制剂）组，通过Micro-CT分析骨微结构，H&E、Masson和免疫组化染色评估组织形态和蛋白表达。

结果

HGHF诱导BMSCs铁死亡

HGHF处理显著抑制BMSCs增殖（EdU染色），增加ROS生成（DHE染色），引起线粒体膜破裂和嵴损伤（电镜观察），并升高脂质过氧化水平（C11 BODIPY）和细胞内Fe²⁺（FerroOrange）。Western blot显示HGHF上调促铁死亡蛋白ACSL4、下调抗铁死亡蛋白GPX4，而Fer-1可逆转这些变化，证实HGHF可诱导BMSCs铁死亡。

FA抑制HGHF诱导的BMSCs凋亡

浓度筛选表明80 μM FA无细胞毒性且抗铁死亡效果最佳。FA处理显著逆转HGHF引起的抗凋亡蛋白Bcl-2下调、促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3上调，免疫荧光进一步验证FA促进Bcl-2表达、抑制Caspase-3激活，表明FA通过调控凋亡通路保护BMSCs。

FA缓解HGHF引起的铁死亡和线粒体功能障碍

FA和Fer-1处理恢复线粒体嵴结构，降低脂质过氧化和Fe²⁺水平，减少ROS生成。JC-1和MitoTracker染色显示FA逆转HGHF引起的线粒体膜电位下降。Western blot表明FA上调线粒体融合蛋白OPA1、下调裂变蛋白DRP1，改善线粒体功能。

FA促进成骨分化和矿化

ALP和Alizarin Red S染色显示FA逆转HGHF对钙结节形成的抑制。Western blot和免疫荧光证实FA上调成骨标志物COL1A1、RUNX2和OCN表达，恢复BMSCs成骨分化能力。

FA通过激活NRF2/GPX4轴抑制铁死亡

分子对接显示FA与NRF2（结合能-9.611 kcal/mol）和GPX4（-7.332 kcal/mol）具有高亲和力。Western blot和免疫荧光表明FA促进NRF2核转位，上调GPX4和HO-1表达，而NRF2抑制剂ML385抵消FA的保护作用，证实FA通过NRF2/GPX4通路抑制铁死亡。

体内实验验证FA改善T2DOP

Micro-CT显示FA治疗显著提高骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th），降低骨小梁分离度（Tb.Sp）。组织染色表明FA增加骨小梁数量、促进胶原沉积和矿化。免疫荧光显示FA上调骨修复相关蛋白OPN、BMP2和NRF2表达，免疫组化证实GPX4表达升高，ML385部分逆转FA疗效，表明FA通过NRF2/GPX4轴抑制铁死亡、改善T2DOP。

讨论

本研究首次阐明FA通过激活NRF2/GPX4通路抑制铁死亡，缓解T2DOP的机制。FA不仅减轻氧化应激和线粒体损伤，还促进成骨分化和骨微结构重建。与传统抗氧化剂相比，FA靶向调控铁死亡关键通路，具有更高特异性。此外，FA天然来源和多重药理活性为其临床转化提供优势。未来需进一步探索FA的药代动力学和长期疗效，为T2DOP治疗提供新策略。

结论

FA通过激活NRF2/GPX4轴抑制铁死亡，减轻线粒体功能障碍和氧化损伤，恢复BMSCs成骨分化能力，在体内外显著改善T2DOP病理进展，是一种潜在治疗药物。