冷等离子体诱导豌豆分离蛋白淀粉样纤维形成及其对高内相乳液的稳定机制研究

本综述系统探讨了冷等离子体（CP）处理协同热处理诱导豌豆分离蛋白（PPI）形成淀粉样纤维（Amyloid Fibrils）的机制及其在高内相乳液（HIPEs）稳定中的应用。研究发现，CP处理通过解折叠PPI的球状结构、切割多肽主链并释放β-折叠（β-strands）结构单元，显著促进纤维的自组装过程。形成的纳米级纤维（直径约12 nm，长度132–261 nm）表现出优异的界面吸附能力和空间稳定性，其稳定HIPEs的效果与纤维长度密切相关。短纤维（CP5PF-2和CP5PF-4）在热稳定性、离子强度和长期储存方面均优于长纤维，为植物蛋白在功能性食品中的应用提供了新策略。

　　

引言

蛋白质因其优异的功能特性和高营养价值，常被用作乳化剂或发泡剂。植物蛋白食品因其健康和环境效益受到全球关注，其中豌豆分离蛋白（PPI）因其高产量、优良营养价值和低过敏性成为最具潜力的替代蛋白之一。然而，植物蛋白的多样组成、紧密天然结构和低溶解度常使其在油水界面稳定吸附面临挑战。因此，通过结构改性提高PPI的乳化性能对其在食品工业中的应用至关重要。

淀粉样纤维是典型的无分支蛋白纤维，直径约10 nm，轮廓长度超过1 μm，由垂直于纤维轴的β-折叠构成重复的交叉β结构。研究表明，乳清蛋白、蛋清蛋白、大豆蛋白和豌豆蛋白等可在酸性加热条件下（pH=2，80°C–90°C）体外制备淀粉样纤维。由于其高刚度、高长径比和高度有序结构，纤维状食物蛋白被认为是促进和调节蛋白质有益功能的有前途的方法。然而，植物蛋白更紧密的结构和较低的溶解度阻碍了其主链水解和β-折叠结构单元的释放，导致纤维化时间延长。为解决这些问题，已开发出多种策略，包括核诱导、酶处理和物理预处理。其中，物理处理因其环境友好和高效而受到极大关注。

冷等离子体（CP）是一种非热、可持续的食品加工技术，近年来在蛋白质改性方面引起广泛兴趣。研究表明，CP干扰蛋白质构象，解折叠其球状结构并切割多肽主链，从而模拟酶水解。这些特性使CP成为促进蛋白质淀粉样纤维形成的有前途的方法。

材料与方法

本研究使用纯度为98%的豌豆分离蛋白（PPI），购自上海盈信实验室设备有限公司。CP处理采用介质阻挡放电（DBD）等离子体发生器进行。将PPI（10 mg/mL）分散在去离子水中，磁力搅拌12 h确保充分水化。取5 mL PPI样品溶液置于石英皿中，在40 kV、14 kHz条件下处理0、3、5和7 min，分别标记为CP-0、CP-3、CP-5和CP-7。未经处理的天然PPI作为对照。

PPI淀粉样纤维的制备参考先前研究并稍作修改。将CP处理的PPI样品在85°C水浴中以100 rpm搅拌加热12 h。在不同时间点（0、0.5、1、2、4、6、8、10和12 h）收集样品，立即冰水冷却并储存于4°C备用。由CP处理5 min的PPI经2、4、8和12 h纤维化制备的淀粉样纤维分别标记为CP5PF-2、CP5PF-4、CP5PF-8和CP5PF-12。

采用ThT荧光分析监测PPI淀粉样纤维的形成。将样品与ThT工作溶液混合后，用微孔板分光光度计在440 nm激发波长和480 nm发射波长下测量荧光强度。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）用于观察纤维形态。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、内在荧光光谱和疏水性分析用于研究PPI的结构变化。

高内相乳液（HIPEs）的制备以CP处理的PPI淀粉样纤维为连续相，与大豆油以1:3的体积比（φ=0.75）混合，在12,000 rpm下均质2 min。通过光学显微镜、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流变学分析评估HIPEs的稳定性。

结果与讨论

CP处理诱导PPI淀粉样纤维的形成

ThT荧光分析显示，与CP-0相比，CP-5和CP-7的ThT荧光强度在最初2 h孵育时间内迅速增加，CP-7达到最大值。随着加热时间延长，CP-3的ThT荧光强度逐渐增加，分别在8 h和10 h达到峰值，而CP-7的ThT值稳步下降。这些结果表明，CP处理结合热处理成功促进并形成了淀粉样纤维结构。CP-7在2 h纤维化时间后ThT荧光强度的下降可能是由于成熟纤维的断裂屏蔽了ThT结合位点。在所有处理中，CP-5表现出最高的纤维组装能力，表明适度的CP介导氧化在蛋白质主链切割和结构解折叠方面优于其他处理，从而促进蛋白质淀粉样纤维的形成。

TEM和SEM分析证实了PPI淀粉样纤维的形成和形态。天然PPI呈现平均直径为26.94 nm的球形聚集体。经过10 h纤维化后，CP-0保留其球形聚集体但直径减小，而CP-3、CP-5和CP-7观察到短棒状纤维结构。CP-3、CP-5和CP-7的淀粉样纤维直径约为12 nm，平均长度分别为132、217和261 nm。结果表明，淀粉样纤维的长度随着CP处理时间的延长而增加。SEM分析支持这些发现，显示天然PPI中的规则球形结构和CP-0中的层状结构。相比之下，经CP处理3、5和7 min的样品中观察到具有光滑表面的棒状淀粉样纤维结构。这些观察与粒度分布分析一致，随着CP处理时间的增加，粒度分布峰向更大尺寸移动，表明CP处理成功促进了PPI的纤维化。

纤维化过程中PPI的结构特征

SDS-PAGE分析显示，经CP处理3、5和7 min的样品中，对应7S（豌豆球蛋白～67 kDa和豆球蛋白～48 kDa）和11S（酸性亚基～39 kDa和碱性亚基～22 kDa）蛋白质的条带几乎完全消失，而观察到低分子量肽和高分子量聚集体（>180 kDa）。对于CP-0，除出现高分子量聚集体外，条带模式未见显著变化。这些结果表明，在纤维化过程中发生了PPI多肽主链的切割，可能是由CP处理过程中产生的活性粒子诱导的。

FTIR分析显示，随着CP暴露时间的增加，PPI的α-螺旋和无规卷曲结构分别从22%减少到16%和从22%减少到17%，而β-折叠和β-转角结构分别从28%增加到34%和从28%增加到33%。这些FTIR发现得到了ThT荧光结果的支持，反映了β-折叠结构作为主要构建单元，在纤维化过程中自组装并堆叠成更连续的β-折叠结构。

内在荧光强度分析显示，加热后最大荧光强度（FImax）显著降低，最大荧光强度波长（λmax）发生红移。PPI的λmax从350.2 nm（对照）逐渐转移到357 nm（CP-5），然后下降到354.8 nm（CP-7）。这些结果暗示，在纤维化孵育过程中PPI分子的结构解折叠导致先前埋藏在其球状结构中的芳香氨基酸残基暴露于更极性的水环境。这种微环境极性的增加导致PPI的荧光猝灭和λmax的红移。

表面疏水性分析显示，经过10 h纤维化孵育后，PPI的表面疏水性随着CP处理时间长达5 min而逐渐降低，随着CP处理时间进一步延长至7 min而略有增加。这些结果暗示，交叉β-折叠构建单元通过疏水相互作用自组装并堆叠成有序的纤维结构，从而掩盖了暴露的PPI疏水基团并降低了表面疏水性。

CP诱导的PPI淀粉样纤维稳定的HIPEs特性

TEM分析显示，与对照相比，天然PPI的球形形态消失，被平均长度为132.21 nm的短棒状纤维取代，表明构建单元（β-折叠）经过2 h纤维化孵育后有序自组装成蛋白质纤维。有趣的是，随着孵育时间从2 h延长到12 h，纤维伸长，PPI纤维的长度从132.21 nm（2 h）持续增加到177.92 nm（4 h）、221.19 nm（8 h）和306.66 nm（12 h）。

HIPEs的特性分析表明，CP5PF有效稳定了HIPEs，表现出凝胶状结构，能够粘附在倒置容器的底部。相比之下，由天然PPI稳定的HIPEs出现明显的油释放和相分离现象，样品从倒置的瓶中滴下。光学显微镜显示，随着孵育时间从2 h延长到12 h，液滴尺寸显著增加。动态粒度分布分析也显示，由CP5PF稳定的HIPEs的平均液滴尺寸从39.3 μm（2 h）逐渐增加到54.6 μm（12 h）。这表明由CP5PF制备的HIPEs的稳定性与PPI淀粉样纤维的长度直接相关。随着纤维化时间的延长，PPI淀粉样纤维的长度增长，而HIPEs的稳定性下降。这一现象可能归因于较长PPI淀粉样纤维的流动性降低，其在油滴界面吸附较差，形成的界面层不如短纤维紧密。

CLSM进一步说明了由CP5PF稳定的HIPEs中油滴的形态和微观结构。所有HIPE样品均显示出典型的水包油（O/W）乳液，蛋白质乳化剂有效吸附在油水界面。此外，随着孵育时间的延长，HIPEs的油滴尺寸增加，与粒度和光学显微镜分析一致。在红色油滴周围观察到明显的绿色环，表明淀粉样纤维主要吸附在油相和水相之间的界面上。淀粉样纤维包裹油滴，形成保护膜，通过产生静电和空间排斥力防止液滴聚集，从而增强HIPEs的稳定性。

HIPEs的流变学特性

流变学分析用于评估由不同纤维化时间的CP5PF稳定的HIPEs微观结构的变化。所有HIPEs的表观粘度随着剪切速率的增加而持续降低，表现出非牛顿假塑性流体的典型剪切稀化特性。这一现象可能归因于随着剪切速率的增加，PPI淀粉样纤维在油滴表面形成的网络结构逐渐破坏，导致高剪切速率下HIPEs的表观粘度降低。另一方面，随着孵育时间的延长，HIPEs的表观粘度逐渐降低。这可能是因为较短的PPI淀粉样纤维形成了更强的空间屏障，有效防止液滴絮凝和乳液分层，从而提高HIPEs的稳定性。

应变扫描分析对于评估乳液的粘弹性至关重要。它有效揭示了HIPEs的微观结构与宏观特性之间的关系，通过储能模量（G′，弹性）和损耗模量（G′′，粘度）反映。所有CP5PF稳定的HIPEs在较低应变幅度范围（>10%）表现出线性粘弹性区域（LVR）。通常，LVR越宽，抗变形能力越好。CP5PF稳定的HIPEs表现出典型的固体样特性，G′ > G′′。随着纤维化时间的增加，G′和G′′值逐渐降低。这些结果与表观粘度分析一致，暗示较短的淀粉样纤维（在2和4 h热处理时间形成）更有效地吸附在油滴表面，形成紧密的界面结构并提高凝胶强度。频率扫描测试显示出类似趋势，G′和G′′线随着频率升高而平行轻微增加，顺序为CP5PF-2 > CP5PF-4 > CP5PF-8 > CP5PF-12。这些结果表明，与由CP处理5 min不同纤维化时间诱导的PPI纤维的不同形态基本有助于提高HIPEs的稳定性，特别是在平均长度方面。较短的纤维（CP5PF-2和CP5PF-4）表现出更好的流动性，能够比长纤维（CP5PF-8和CP5PF-12）更有效地吸附在油水界面。短棒状纤维的更灵活和各向异性特性使其更有效地形成致密和有弹性的界面层，从而防止液滴絮凝、聚结并提高整体乳液完整性。

HIPEs的热、离子和储存稳定性

热处理是食品加工中常见的灭菌程序，以防止细菌污染并延长食品保质期。CP5PF稳定的HIPEs在60°C、75°C和90°C下的热稳定性评估显示，所有CP5PF稳定的HIPEs在所有热处理温度下均表现出良好的稳定性，除了由CP5PF-8和CP5PF-12制备的HIPEs在75°C和90°C下未形成凝胶状乳液。光学显微镜和动态粒度分布分析显示，随着加热温度从60°C升高到90°C，CP5PF制备的HIPEs的油滴粒度显著增加。应变扫描流变学分析表明，热处理对所有CP5PF制备的HIPEs的稳定性有显著影响。所有样品在60°C、75°C和90°C下的G′和G′′值显著下降，下降程度随着温度升高而加剧。然而，与由CP5PF-8和CP5PF-12稳定的HIPEs相比，由CP5PF-2和CP5PF-4制备的HIPEs在所有温度下表现出更好的稳定性。这些发现证实，具有较短纤维长度的PPI淀粉样纤维（CP5PF-2和CP5PF-4）有效吸附在油滴界面，形成更耐热处理的紧密网络结构。

在食品加工中，NaCl的添加抑制细菌和霉菌的生长，延长食品保质期。离子强度（100–500 mM NaCl）对由不同孵育时间的CP5PF制备的HIPEs的外观、微观形态和油滴尺寸的影响表明，所有HIPE样品未发生相分离并保持凝胶状外观。此外，HIPEs的油滴在所有离子强度下表现出均匀且均一的粒度，紧密排列并相互粘附。这些发现与动态粒度分析结果一致。流变学分析显示，在所有离子强度下，G′值保持高于G′′值，表现出典型的胶体行为和优异的离子稳定性。与未添加离子的样品相比，离子强度对CP5PF稳定的HIPEs的流变特性影响较小，表明带电离子的存在增强了油滴结合和乳液硬度。这一现象可能归因于NaCl离子屏蔽了PPI淀粉样纤维之间的静电排斥，促进了粒子扩散和吸附在油水界面，从而增加了CP5PF制备的HIPEs的稳定性。

CP5PF稳定的HIPEs在28天期间的储存稳定性显示，在储存期间HIPEs的外观未见显著差异；未发生油析出或乳液分层，并且乳液在倒置放置28天后仍保持高度自支撑。微观形态和动态粒度分析显示，随着储存时间的延长，油滴尺寸逐渐增加。然而，与由CP5PF-8和CP5PF-12稳定的HIPEs相比，由CP5PF-2和CP5PF-4稳定的HIPEs的油滴尺寸增加较小。应变扫描流变学分析得出类似结果，显示所有HIPEs的G′和G″值随时间略有下降。然而，CP5PF-8和CP5PF-12的下降明显大于CP5PF-2和CP5PF-4。总体而言，这些发现表明CP5PF稳定的HIPEs表现出优异的储存稳定性，较短长度的PPI淀粉样纤维（CP5PF-2和CP5PF-4）优于较长纤维。

结论

本研究证明了CP处理结合热处理诱导PPI淀粉样纤维的形成。与天然PPI相比，由CP诱导的PPI淀粉样纤维稳定的HIPEs的稳定性显著增强。对HIPEs特性的研究表明，HIPEs的稳定性与棒状PPI淀粉样纤维的长度直接相关。这可能归因于较长PPI淀粉样纤维流动性较差，吸附在油滴界面的效率较低，形成的界面层不如短纤维紧密。总之，CP为诱导PPI淀粉样纤维形成和提高其稳定HIPEs的能力提供了一种有前途的替代传统耗时酸性热处理的方法。尽管证实了CP处理促进蛋白质淀粉样纤维形成的能力，但应进一步研究调节蛋白质淀粉样的形状和特性及其在实际应用中的增强功能。