细菌纳米纤维素负载肉桂醛：一种延长面包货架期的清洁标签策略

本研究创新性地利用细菌纳米纤维素（BNC）作为天然抗菌剂肉桂醛（CIN）的纳米载体，开发了一种清洁标签的食品保鲜系统。通过绿色合成工艺制备BNC，并系统评估了其负载CIN后的抗菌活性（MIC测定、抑菌圈实验）及在面包基质中的应用效果。结果表明，CIN-BNC能显著抑制常见真菌（如Penicillium chrysogenum、Aspergillus niger等）生长，将面包货架期延长至21天以上，且不影响产品结构完整性。该研究为替代合成防腐剂（如丙酸钙）提供了安全有效的解决方案，契合清洁标签食品市场需求，在烘焙工业及更广泛食品领域具有应用潜力。

　　

1. 引言

食品保鲜是食品工业加工中的关键环节，传统上通过使用合成添加剂（如丙酸、山梨酸、苯甲酸和亚硝酸盐）来实现。这些化合物以其抑制微生物生长和延长加工产品货架期的有效性而闻名。然而，近期研究已将长期摄入这些添加剂与不良健康效应联系起来，包括肠道菌群失调、免疫失调和神经系统疾病，特别是在易感人群中。在此背景下，市场对能够替代合成防腐剂而不影响微生物安全性和食品稳定性的天然替代品的需求日益增长。植物源化合物，特别是精油（EOs），因其抗菌和抗氧化特性而受到关注，同时满足了清洁标签和健康导向食品产品的需求。

在广泛应用的精油中，肉桂精油因其主要生物活性成分肉桂醛（CIN）的强效抗菌活性而脱颖而出。CIN（又称3-苯基-2-丙烯醛，或肉桂醛）对多种食源性病原体（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌）表现出广谱抗菌活性。其抗菌功效归因于多种作用机制，包括破坏微生物细胞质膜、增加膜通透性、抑制关键酶促过程以及通过产生活性氧（ROS）诱导氧化应激。尽管其效力强大，但由于其高挥发性、易氧化降解和强烈的感官影响，CIN在食品基质中的直接应用面临技术挑战。

从监管角度看，CIN被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为一般公认安全（GRAS）物质，可用于食品产品，并被欧洲食品安全局（EFSA）批准作为调味剂。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）已设定其每日允许摄入量（ADI）为1.25 mg/kg体重/天，支持其在受控水平下对人类消费的安全性。然而，其感官影响必须谨慎考虑。CIN具有强烈刺激性香气和低感官阈值，即使在亚抑制浓度下也可能影响食品的风味特征。因此，能够实现控释的策略，例如将其纳入细菌纳米纤维素（BNC）等纳米结构载体，对于在保持抗菌效力的同时最小化不良感官效应至关重要。

生物活性化合物的包封载体系统已成为提高稳定性、生物利用度和控释能力的有前景策略，增强了其在食品应用中的有效性和功能性。在最有前途的包封系统中，BNC因其独特的物理和化学特性而成为一种高度通用的生物聚合物。BNC由纯纤维素纳米纤维排列成三维多孔网络构成，具有高结晶度、拉伸强度和大比表面积，有利于活性化合物的吸附和控释。其纳米级结构通常具有20至100 nm的纤维直径，有助于增强与目标分子的相互作用。BNC由非致病性细菌（如Komagataeibacter xylinus）在温和发酵条件下利用可再生底物生物合成。这种微生物过程相较于植物源纤维素具有多种优势，包括更高纯度、无木质素和半纤维素以及可调形态。此外，BNC完全可生物降解、生物相容，并通过环境友好方法生产，符合绿色化学原则和可持续发展目标。

天然剂与纳米颗粒基包封系统的整合代表了一种创新且可持续的食品保鲜方法，具有延长货架期、增强食品安全性和减少对合成添加剂依赖的潜在优势。在此背景下，本研究旨在开发一种基于CIN掺入BNC的食品保鲜系统，评估其抗菌性能及其在烘焙产品中的应用潜力。

2. 材料与方法

2.1. BNC的生产

BNC使用Komagataeibacter xylinus（ATCC 53582）生产。预培养物在含有Hestrin和Schramm（HS）液体培养基的锥形瓶中进行制备，该培养基由20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物、1.15 g/L无水磷酸钠和1.15 g/L一水合柠檬酸组成。培养物在30°C下静态孵育48小时。此后，细菌培养在含有补充了10%（v/v）预培养物的HS培养基的无菌塑料容器中进行。培养在30°C下静态保持10天。

在此阶段结束时，所得细菌纤维素膜通过浸入1 M NaOH中，在60°C下保持90分钟进行纯化，以去除残留细菌细胞。然后使用蒸馏水冲洗膜直至达到中性pH，遵循Jozala等人描述的方法。

中和后，膜使用工业搅拌机混合，并使用Ultraturrax均质器分散5分钟以减少粒径。混合后的物质转移至细网筛中以去除多余水分。

为获得BNC，使用5 g混合细菌纤维素与15 mL Milli-Q水的比例。混合物在持续搅拌下加热至50°C，并加入500 μL纤维素酶（来自Trichoderma reesei，≥700 U/g，Sigma-Aldrich）。酶降解过程通过视觉监控，30分钟后，温度升至100°C保持20分钟以灭活酶。过程结束时，混合物以5500 rpm离心20分钟，收集含有分散BNC的上清液，方法 adapted from Soeiro等人。

2.2. 纳米颗粒表征

BNC样品使用纳米颗粒追踪分析（NTA）进行表征，仪器为NanoSight PRO（Malvern Instruments，英国），配备高灵敏度相机并通过NS Xplorer软件（版本1.2.0.3）控制。样品以1:100比例在Milli-Q水中稀释，以达到最佳颗粒浓度范围（10⁶–10⁹颗粒/mL），如制造商所推荐。所有测量在25°C下进行，每个样品获取五段60秒的视频记录。数据使用集成软件进行分析，该软件通过跟踪布朗运动确定流体动力学直径（平均值和众数）、尺寸分布和颗粒浓度（每毫升颗粒数）。该技术能够准确表征多分散纳米颗粒悬浮液，并广泛应用于纤维素基纳米材料。

2.3. 将天然活性化合物掺入BNC

将CIN油和肉桂提取物以1:1（v/v）的比例在Falcon型管中掺入BNC。混合物在摇床（NT 715, Nova Técnica）中于25°C、100 rpm下孵育4小时，遵循 adapted from Malheiros等人的方案。CIN（肉桂醛；≥98%纯度）购自巴西Vidara公司。肉桂提取物为20%的Cinnamomum zeylanicum树皮水醇酊剂，通过渗滤/浸渍使用56°乙醇-水溶液制备，由Botica Alternativa Homeopatia Ltda（巴西）提供。

2.4. 最低抑菌浓度（MIC）

使用Aspergillus niger（ATCC 5275）、Penicillium chrysogenum（ATCC 48905）和Rhizopus microsporus var. oligosporus（ATCC 22959）的商业菌株进行肉桂提取物和CIN油的MIC测定。在微孔板的每个孔中，依次加入100 μL沙氏葡萄糖肉汤、10 μL每种真菌接种物（10⁶ CFU/mL）和100 μL测试化合物。

肉桂提取物以20%的初始浓度测试，CIN以100%测试。每板包括阴性对照（无接种物的培养基）和阳性对照（无测试化合物的接种物）。板在25°C下孵育72小时。

为控制CIN的挥发性并避免MIC测定中可能的跨孔扩散，所有微孔板在加入化合物和接种物后立即用Parafilm密封。然后板在静态条件下孵育。此步骤有助于最小化气相干扰并确保MIC测定的更高可靠性。

通过将10 μL从每个孔转移至沙氏琼脂板评估真菌生长。MIC定义为显示72小时后无可见真菌生长的天然化合物的最低浓度。

2.5. 倒置抑菌圈测定和稳定性

使用倒置抑菌圈法在固化沙氏琼脂板上评估BNC掺入化合物的抗真菌活性。将200 μL真菌悬浮液（10⁶ CFU/mL）均匀涂布在琼脂表面。随后，在每个板中心打孔（直径10 mm）。这些孔填入游离活性化合物或BNC掺入化合物（每孔20 μL）。掺入以1:1比例进行，导致肉桂提取物最终浓度为10%，CIN油为50%。此比例基于初步测试以确保配方稳定性和适当分散。由于CIN是纯化化合物，比粗制肉桂提取物具有更高抗菌活性，本研究不旨在以摩尔基础比较它们。相反，它侧重于证明BNC作为简单和复杂天然化合物载体的适用性。

板在25°C ± 1°C下孵育3天。每天使用数字卡尺在四个点测量抑菌圈直径，所有测定进行三次。最终产品（BNC掺入化合物）的稳定性在化合物掺入后0、7、14和21天评估。

2.6. 在面包基质中的应用

制备四个面包条（500 ± 30 g），使用以下成分：288.5 g小麦粉、5.5 g奶粉、14 g糖、5 g盐、8.5 g人造黄油、85 g新鲜酵母和170 mL温水。制备在层流罩下无菌进行。混合物使用面包机（Mondial Master Bread）在“快速”设置下处理，持续1小时55分钟。

面包条分配如下：阴性对照（N，无防腐剂）、阳性对照（P，含0.1%丙酸钙，遵循巴西国家卫生监督局（ANVISA）指南）、游离CIN油（CIN，625 μL）和掺入BNC的CIN油（NCIN，625 μL）。

烘烤后，每个面包条切成三片（约5 cm厚）并在层流下冷却。切片然后储存在先前经UV光灭菌60分钟的聚乙烯袋中。样品储存在干燥、通风、无味的环境中，遵循商业面包包装上的储存建议。每天监测真菌生长。

使用的CIN量基于JECFA建立的1.25 mg/kg体重/天的ADI。

2.7. 定量真菌生长评估

在面包生产后第7、14和21天进行真菌生长定量，进行三次，使用 adapted from Filipe and Chiu的方法。简要来说，25 g面包样品研磨并在225 mL 0.1%蛋白胨水中均质（10^-1初始稀释）。制备系列稀释（10^-2和10^-3），并从每个稀释中取1 mL等分试样铺板于沙氏软琼脂上。板在25°C ± 1°C下孵育最多48小时以监测真菌生长。

2.8. 统计分析

对于稳定性测试，使用Student's T检验比较CIN和NCIN处理。对于时间点比较（0、7、14和21天），使用单因素ANOVA，随后进行Tukey事后检验。显著性设定为p < 0.05。

3. 结果与讨论

3.1. 纳米颗粒表征

BNC显示出18.5 nm的平均粒径和3.64 × 10⁸颗粒/mL的浓度，符合纳米材料分类（至少一个维度<100 nm）。这些结果证实了酶水解作为BNC生产的一种可持续且可重复方法的有效性，强化了其作为生物活性化合物载体的潜力。

含有CIN（0.5%–5.0%）的壳聚糖/聚环氧乙烷纳米纤维显示，50 nm颗粒增强了化合物的抗菌活性， corroborating the role of BNC as a carrier for bioactive compounds。粒径减小与精油抗菌效力的增加相关，允许使用更少量防腐剂而达到等效效力， due to the higher bioavailability provided by the high surface-to-volume ratio, which facilitates cellular penetration of active compounds。除粒径和比表面积外，其他物理化学特性，如表面电荷（Zeta电位）、形状和包封化合物的控释行为，显著影响纳米载体在食品系统中的稳定性和功能性。这些因素影响与食品基质的相互作用，调节生物活性化合物的释放动力学，并最终决定其抗菌性能。在此背景下，BNC作为化合物载体可能有助于延长食品（如面包）的货架期。

3.2. MIC

针对Penicillium chrysogenum的结果显示。在5%肉桂提取物浓度下观察到真菌生长。相比之下，CIN油在所有测试浓度下抑制真菌发育，包括最低（0.19%），因此在此测试范围内无法确定MIC。

本研究中使用的肉桂提取物显示出较先前研究（如Hossain等人和Sassi等人）报道的肉桂精油更低的抗真菌效力，他们观察到抑制值为2500 ppm（0.25%）。

对于Aspergillus niger，肉桂提取物在10%浓度下发生生长。CIN油即使在最低浓度0.19%下也抑制真菌生长。这些发现与文献一致，特别是与Hossain等人获得的结果相比，他们报道了肉桂精油在2500 ppm（0.25%）下的抗真菌效应。

关于Rhizopus microsporus var. oligosporus，肉桂提取物在5%下检测到真菌生长，而CIN油再次在所有测试浓度下抑制生长，即使在最低（0.19%）下。本研究中使用的肉桂提取物对此菌株显示出较Horváth等人使用肉桂精油获得的结果更低的效力，后者在25,000 ppm（2.5%）下显示出抑制。

不同研究间观察到的抗真菌效力差异可能归因于肉桂基产品的性质和组成。根据Kalemba和Kunicka，富含酒精基化合物的提取物与精油相比表现出更低的抗真菌活性，后者含有更高浓度的生物活性挥发性化合物。支持此解释，Reinoso和Timbi通过体外敏感性测试证明，Cinnamomum verum的精油比其酒精提取物对Candida albicans具有更大的抗真菌有效性。

值得注意的是，Huang等人阐明，反式CIN通过涉及破坏真菌细胞膜的机制发挥抗真菌活性。该化合物整合到细胞质膜的疏水区域，导致外真菌膜解体。这种结构损伤损害基本细胞功能并导致细胞死亡，这支持了观察到的CIN对测试菌株的高抗真菌效力。

3.3. 倒置抑菌圈测试和稳定性

此测定旨在评估活性化合物掺入BNC后的抗真菌活性和时间稳定性，并与它们的游离形式比较。根据Nguyen Van Long等人，将精油包封在控释系统中可以增强其生物稳定性和优化剂量。

肉桂提取物（无论是纯形式还是掺入BNC）对测试真菌菌株缺乏抑菌圈可能与其化学成分相关。此类提取物中酒精基化合物的 predominance 已知具有较低抗真菌潜力，如先前Kalemba和Kunicka所讨论。相比之下，纯CIN及其掺入形式（NCIN）对所有真菌菌株显示完全生长抑制，对Penicillium chrysogenum在时间零时表现出特别显著的活动。

CIN对Penicillium chrysogenum的抗真菌活性在所有评估期间一致，确认了其作用机制（由Huang等人描述），涉及破坏质膜。此效应归因于化合物对细胞质膜疏水域的亲和力，导致结构损伤和细胞完整性丧失。

对其他真菌菌株观察到类似结果。显示了对Rhizopus microsporus var. oligosporus和Aspergillus niger的抑菌圈。在两种情况下，CIN和NCIN从第一次评估时间点应用形式的CIN抑制真菌生长。对于Aspergillus niger，真菌生长仅在48小时后开始，这被确立为观察基线。

这些发现与文献一致。Sassi等人强调了柑橘提取物和纯肉桂精油对各种真菌的高性能，强化了CIN（其主要活性化合物）作为本研究中最有效的真菌生长抑制剂的作用。

关于稳定性，商业CIN仅在时间零评估，因为其组成预期不会显著变化。对于NCIN配方，对Rhizopus microsporus var. oligosporus的抗真菌活性在时间零时与CIN相当（p > 0.05）。然而，7天后观察到效力显著降低，随后在14天部分恢复，表明配方内可能的重组过程。随后的21天下降表明稳定性限制，需要优化以确保更持久的抗菌作用。表1呈现了随时间变化的抑菌圈测量。

数据揭示，将CIN掺入纳米结构基质影响其随时间对抗此菌株的抗微生物活性。在早期（0和7天），NCIN配方显示抗真菌活性较纯CIN显著降低。然而，从第14天起，效力恢复，抑菌圈与CIN统计相似。

此恢复可能归因于再分散或聚合物相互作用松弛，这可能 facilitated renewed release as supported by the ability of nanocellulose to provide sustained delivery through its porous structure and high surface area。在21天，观察到抑菌圈大小新下降，表明活性化合物随时间可能降解。

包封在BNC中的活性化合物的释放可能通过水解酶（如纤维素酶和半纤维素酶）的作用发生，这些酶由丝状真菌胞外分泌。来自Trichoderma、Penicillium和Aspergillus属的物种因其显著分泌这些酶的能力而突出，这些酶对于降解植物生物质中存在的顽固聚合物（如纤维素、半纤维素、果胶和木质素）至关重要。酶分泌可能通过涉及内膜系统的常规途径和非常规途径发生。在此背景下， plausible that, upon interacting with BNC particles loaded with CIN, these fungi promote partial degradation of the nanocellulose matrix, favoring the localized release of the active compound。此外，当包封在小直径液滴中时，非极性生物活性化合物表现出更高的表面体积比，这增加了它们的生物利用度和与生物结构相互作用的能力。这些纳米结构 facilitate the penetration of CIN into fungal cell membranes, enhancing its disruptive effects on cellular integrity，如图8所示。

NCIN配方对Aspergillus niger的稳定性显示在表2中。观察期在48小时开始，当最初检测到真菌生长时。

此时间行为表明BNC可能作为控释系统，延迟CIN的释放并在初始适应阶段后延长其抗微生物活性。然而，长期稳定性似乎有限，特别是超过2周。

控释包封等技术已证明有效保护活性化合物免于降解和氧化，改善溶解度，最小化不良感官变化，并增强其抗微生物效力。此外，该技术增加稳定性，减少蒸发，并改善疏水性化合物（如所用活性成分）的生物利用度和溶解度。

先前研究支持本工作获得的结果。Maior等人报道，15% CIN在固体培养基扩散测试中对Candida albicans显示统计抑制，行为类似于此处研究的真菌菌株。此外，作者报道剂量依赖性响应，在更高浓度下更大的抑菌圈，维持超过24和48小时，以及在第4和7天。

在本研究中，尽管在NCIN配方中使用一半CIN浓度（由于1:1掺入比例），抗真菌效力在几个时间点保持统计等效。这表明CIN和BNC之间潜在的协同效应或纳米结构基质在储存期间保持生物活性的稳定作用。

3.4. 在面包中的应用

所有组的面包切片每天视觉监控，并记录通过宏观分析观察到的真菌菌落数（表3）。

视觉检查显示两个对照面包（N和P）在第5天出现真菌生长，在含有丙酸钙的阳性对照中观察到更少菌落。相比之下，CIN和NCIN处理的面包直至第21天保持无可见真菌生长（表3和图9），证明有效延长货架期而无化学防腐剂。

3.5. 定量真菌计数

定量分析确认视觉观察。在第7天，仅N和P样品显示真菌生长，菌落数分别为2.88 × 10⁵和1.72 × 10⁵ CFU/g（图10）。尽管P的值低于阴性对照，它仍然超过巴西法规建立的微生物安全限。这些发现表明，虽然丙酸钙提供部分保护，其防腐效应在储存几天后有限。相比之下，在第7天，CIN和NCIN样品的任何稀释板中未观察到真菌生长。

定量测定在第14和21天使用每个稀释三次重复进行。对于阴性对照（N）和丙酸钙对照（P）面包，所有稀释变得不可计数，表明微生物负载远高于监管限。相比之下，CIN和NCIN面包在两个时间点的所有板上保持无真菌菌落（图11）。这些结果表明处理面包相较于未处理面包货架期延长16天。

根据规范性指令No. 313（2024年9月4日）和决议RDC No. 724（2022年7月1日），烘焙产品中霉菌和酵母的最大可接受限为5 × 10⁴ CFU/g。在进行的测试中，含有CIN和NCIN的面包显示完全无真菌菌落，表明微生物符合监管标准。

此结果特别相关，因为如Silveira报道，商业面包的平均货架期约为21天，通过合成防腐剂在面团和表面应用实现。CIN和NCIN直接掺入配方证明是延长货架期而不损害产品微生物安全性的有效替代方案。

类似结果由Ju等人报道，他们观察到使用肉桂精油在常规包装中延长绿豆糕（9–10天）和香酥脆饼（3–4天）的货架期。相比之下，本配方实现超过21天的货架期，归因于CIN的掺入—一种比肉桂精油更浓缩和生物活性的化合物。

3.6. 研究局限性

本研究有一些局限性。未进行物理化学分析（如FTIR、DLS和UV-Vis）以评估BNC负载CIN随时间的结构稳定性，限制了对纳米颗粒完整性的洞察。也未测量活性化合物的掺入效率。我们承认这些局限性，并建议未来研究解决它们以进行更稳健的评估。

4. 结论

CIN表现出强效抗真菌活性，特别是在掺入BNC时，有效延长面包的微生物货架期而不改变其结构完整性。纳米技术与天然防腐剂的组合证明是合成添加剂的一种有前景且安全的替代方案，符合清洁标签食品解决方案的需求。这些发现强调了BNC作为生物活性化合物在食品保鲜中的功能性载体的潜力，为其在各种食品基质中的应用铺平道路。未来研究应聚焦于感官评估，以及扩展此技术用于工业用途的技术和经济可行性。