黄粉虫（Tenebrio molitor）水解产物的生物活性肽表征与鉴定：抗氧化、抗糖尿病及抗高血压潜力研究

本研究系统评价了黄粉虫粉及其蛋白浓缩物通过风味蛋白酶（Flavourzyme）、碱性蛋白酶（Alcalase）和中性蛋白酶（Neutrase）酶解产生的生物活性肽。结果表明，酶解显著提高了产物的可溶性蛋白含量、自由基清除能力（ABTS、DPPH）、铁还原能力（FRAP）以及对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和血管紧张素转化酶（ACE）的抑制活性。研究通过蛋白质组学鉴定出38种潜在生物活性肽，并利用生物信息学预测了其抗氧化（Antioxidant）、抗糖尿病（Antidiabetic）及抗高血压（Antihypertensive）功能，为昆虫蛋白在功能性食品中的应用提供了理论依据。

　　

1 引言

昆虫作为潜在的替代蛋白质来源，近年来被广泛研究作为酶解获得生物活性肽的底物。本研究旨在评估黄粉虫（Tenebrio molitor）粉及其蛋白浓缩物通过酶解生产具有抗氧化、抗糖尿病和抗高血压特性水解产物的潜力。采用风味蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶，根据混合物实验设计进行水解。

2 材料与方法

2.1 试剂

所有试剂均为分析级，包括2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）、ABTS、DPPH、Trolox、风味蛋白酶（来自Aspergillus oryzae）、碱性蛋白酶（来自Bacillus licheniformis）和中性蛋白酶（来自Bacillus amyloliquefaciens）。

2.2 水解底物制备

黄粉虫粉通过研磨获得，蛋白浓缩物通过碱溶酸沉法制备。将虫粉分散于0.2%氢氧化钠溶液中，调节pH至11，离心后取上清液，调节pH至4.5进行等电沉淀，再次离心后得到蛋白浓缩物。

2.3 蛋白酶活性测定

采用偶氮酪蛋白法测定蛋白酶活性，以每分钟吸光度变化0.01定义为1单位酶活（U）。

2.4 酶解过程

根据混合物实验设计（表1），对黄粉虫粉及其蛋白浓缩物进行10组酶解实验。酶解在50°C、100 rpm条件下进行2小时，后通过热处理终止反应，离心取上清液用于后续分析。

2.5 蛋白含量测定

采用Lowry法测定可溶性蛋白含量，以卵清白蛋白为标准曲线参照。

2.6 游离氨基含量测定

采用TNBS法测定游离氨基含量，以L-亮氨酸为标准曲线参照，结果以毫克亮氨酸当量每毫升样本表示，并转换为相对于总蛋白含量的百分比。

2.7 抗氧化特性

通过ABTS、DPPH自由基清除能力和FRAP法评估抗氧化活性，结果以微摩尔Trolox当量每克蛋白（μmol TEq g^?1）表示。

2.8 抗糖尿病特性

通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性评估抗糖尿病潜力，结果以抑制百分比表示。

2.9 ACE抑制活性

通过抑制血管紧张素转化酶（ACE）活性评估抗高血压潜力，结果以抑制百分比表示。

2.10 超滤分级

采用30、10、5和3 kDa超滤膜对水解产物进行分级，并测定各分级组分的生物活性。

2.11 质谱分析

通过微液相色谱-质谱联用技术（μLC-MS/MS）鉴定小于3 kDa肽段序列，使用ProteinLynx Global Server搜索UniProtKB数据库（Coleoptera，Taxon ID: 7041）。

2.12 统计学分析

所有实验均重复三次，结果以均值±标准差表示，采用ANOVA和Tukey检验进行显著性分析（p< 0.05）。

3 结果与讨论

3.1 可溶性蛋白与游离氨基含量

中性蛋白酶处理的水解产物可溶性蛋白含量最高，黄粉虫粉水解物（MF-H3）比未水解样本提高约221%，蛋白浓缩物水解物（MPC-H3）提高约211%。风味蛋白酶处理导致游离氨基含量显著增加，MF-H1和MPC-H1分别比对照提高2.3倍和18倍。相关性分析表明，两种底物的蛋白溶出和游离氨基生成 profile 高度一致（R² > 0.94），说明酶解行为不受底物组成差异影响。

3.2 生物活性特性

3.2.1 抗氧化特性

未水解样本显示出最高的抗氧化活性，可能由于脂质氧化干扰或蛋白浓度校正偏差。风味蛋白酶处理的水解物在ABTS和DPPH自由基清除活动中表现最佳，MPC-H1的ABTS活性达373.51 μmol TEq g^?1。FRAP活性最高见于未水解样本。相关性分析显示两种底物的抗氧化活性高度一致（R² > 0.87）。

3.2.2 抗糖尿病与抗高血压特性

碱性蛋白酶处理的水解物对α-淀粉酶抑制活性最高（MF-H2和MPC-H2分别为19.88%和27.89%）。α-葡萄糖苷酶抑制活性最高见于三元酶组合处理样本（MF-H8和MPC-H7分别为15.36%和17.36%）。ACE抑制活性最高见于三元酶组合以中性蛋白酶为主的MF-H9（57.04%）和碱性蛋白酶与中性蛋白酶二元组合的MPC-H6（54.69%）。

3.3 超滤分级

风味蛋白酶处理的水解物经超滤分级后，小于3 kDa组分占比最高（MF-H1为47.91%，MPC-H1为44.28%），该组分在ABTS、DPPH和FRAP assays中均显示最高相对抗氧化活性（100%）。

3.4 肽段鉴定与生物信息学预测

从小于3 kDa组分中鉴定出38种肽段，分子量范围525–1546 Da。通过BIOPEP数据库预测，这些肽段包含已知生物活性序列，如YAAAPVAVAK（抗氧化、ACE抑制、胰脂酶抑制）。体外预测显示序列ADEYDPHPQY、GGYGGY、APLAYGAPVAKY和APLAYSGGYLH具有自由基清除潜力（FRS评分>0.5）。分子对接表明肽段LPAIL与ACE活性位点（Trp279、Gln281、His353等）有高亲和力（p= 0.000178），与经典抑制剂卡托普利有6个共同作用残基（Ala354、Glu384等），强烈提示其抗高血压潜力。

4 结论

黄粉虫是生产抗氧化、抗糖尿病和抗高血压肽的优质底物。酶解显著提升可溶性蛋白含量和生物活性，且不需预先制备蛋白浓缩物即可获得高活性产物。风味蛋白酶是最佳酶解工具，其水解产物中鉴定出的肽段经生物信息学验证具有多重生物活性。分子对接与晶体结构比对强化了预测可靠性。未来研究应聚焦于这些肽段的生物可及性、口服利用度及毒性评估，以推动其在功能性食品和营养保健品中的应用。