超声、高压与脉冲电场处理对红甜菜副产物甜菜色素提取及贮藏稳定性的比较评估

本综述系统比较了超声（UAE）、高压（HPAE）与脉冲电场（PEF）三种非热绿色提取技术对红甜菜副产物（果皮RBP与茎秆RBS）中甜菜色素（betalains）、总酚（TPC）、黄酮（TFC）及抗氧化活性（AOX）的提取效率与贮藏稳定性。研究发现，超声处理（300 W, 10 min）提取效率最高，且甜菜色素在120天冷藏贮藏中遵循一级降解动力学，而AOX活性则呈零级增长。研究为食品与保健品工业开发稳定、功能性植物基原料提供了重要理论与技术支撑。

　　

1 引言

食品色泽是消费者感知与接受度的关键因素。人工合成色素的使用存在食品安全与欺诈隐患，而天然色素如甜菜色素（betalains）、花青素、姜黄素等虽安全性高，却对热、pH、氧、金属离子、光照等敏感，稳定性差且成本高。甜菜色素是一类含氮水溶性色素，主要包括红紫色甜菜红素（betacyanin，λ_max ~540 nm）和黄色甜菜黄素（betaxanthin，λ_max ~480 nm），两者共享甜菜醛酸（betalamic acid）核心结构。甜菜色素具有抗氧化、抗自由基和抗菌活性，在食品工业中作为健康促进化合物备受关注。红甜菜作物中甜菜色素含量在400–6000 mg/kg之间，作为生物着色剂具有经济可行性，并被欧盟批准为天然色素（E162）。

甜菜色素积累在植物细胞的表皮和亚表皮层，其稳定性受内在因素（色素浓度、pH、金属离子、水分活度、内源酶、食品基质）和外在因素（提取方法、溶剂、光、温度、氧、水分含量）的共同影响。因此，选择非热提取方法并结合安全溶剂，可有效破坏细胞膜，促进天然色素的溶出与回收。机械辅助提取（超声）、压力辅助提取（高压）和电辅助提取（脉冲电场，PEF）等新兴环保技术已被广泛应用于生物活性化合物的提取。

尽管天然色素在食品系统中的应用日益受到关注，但其实际应用仍受限于加工和贮藏条件下的不稳定性。甜菜色素对pH、光、温度、氧和酶活性等环境因素敏感，这些因素在真实食品基质中普遍存在。例如，热处理会导致甜菜红素显著降解，造成颜色损失和抗氧化潜力下降；巴氏杀菌和氧暴露也会迅速降解甜菜色素，降低其功能价值。此外，贮藏期间的不稳定性也限制了甜菜色素基着色剂在长货架期产品中的商业应用。尽管高压或超声等先进提取技术可提高色素回收率，但提取后降解仍然发生，尤其在氧化或高湿环境中。食品基质本身也会影响色素稳定性，与蛋白质、糖或pH缓冲液的相互作用可能加速降解或改变颜色强度。

为有效管理生产、运输和贮藏条件，必须深入了解天然色素在食品产品中的稳定性。本研究独特地探讨了从红甜菜果皮（RBP）和茎秆（RBS）中提取的甜菜色素在三种非热绿色提取技术（UAE、HPAE、PEFAE）下的长期稳定性。尽管先前研究主要关注即时提取产量或提取动力学，但本研究通过评估贮藏期间甜菜色素的提取后稳定性，填补了关键的研究空白。此外，通过针对未充分利用的红甜菜副产物（果皮和茎秆），本研究支持可持续价值化策略，并提供了关于每种环保创新方法如何影响天然色素随时间保存的比较见解，这对于它们在食品系统中的工业应用至关重要。

2 材料与方法

2.1 材料与化学品

红甜菜（Beta vulgaris L.）购自加拿大魁北克Pointe-Claire的Maxi & Cie。选取无外部损伤和微生物侵袭的红甜菜，用自来水冲洗后去皮（果皮宽度3 ± 1 mm），茎秆与叶子分离。果皮和茎秆在-20°C下快速冷冻后，使用冷冻干燥机（Martin Christ GmbH，德国）在-55°C冷凝器温度下进行冻干。冻干过程在10°C、0.85 mbar压力下进行48 h。冻干后的果皮和茎秆样品使用研磨机（Retsch GmbH，GM 200，德国）研磨至粒径小于0.1 mm，并储存于-20°C的棕色玻璃容器中直至使用。

所有化学品和试剂均为分析级，购自加拿大安大略省的Fisher Scientific， except 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid（Trolox）购自美国密苏里州的Sigma-Aldrich。所有实验均使用HPLC级水配制所需化学浓度。

2.2 红甜菜果皮与茎秆中甜菜色素的提取实验设计

采用绿色提取方法，即UAE、HPAE和PEFAE，从RBP和茎秆中提取甜菜色素（甜菜红素 + 甜菜黄素）。所有提取方法中，冻干RBP/茎秆粉末与含0.2%柠檬酸和0.1%抗坏血酸（50:50）的水溶液按固液比1:50 g/mL混合。选择柠檬酸和抗坏血酸混合物作为溶剂系统是基于提取效率和甜菜色素稳定化的双重考虑。柠檬酸有助于维持酸性环境（pH ~4.3–4.4），减少色素水解和颜色降解；抗坏血酸作为天然抗氧化剂，最小化提取过程和后续贮藏中的氧化应激。

UAE使用超声探头系统（SONICS Vibra cellTM，VCX 500，500 W，20 kHz，美国康涅狄格州）在以下条件下进行：振幅60%，脉冲（开:关）5 s:5 s，温度25°C ± 2°C，时间10和20 min。为控制温度，所有UAE处理在冰水浴中进行，温度监测并维持在25°C ± 2°C。HPAE使用 pilot-scale 高压设备（ACIP 6500/5/12VB-ACB Pressure Systems，法国南特）在不同压力（150和350 MPa）和时间（10和20 min）下进行。冻干红甜菜样品与溶剂按固液比1:50 g/mL混合后装入塑料袋，密封并置于高压腔中进行处理。PEFAE使用高压发生器和批量平行板处理室（TC-01001；麦吉尔大学Macdonald校区食品过程工程实验室）在场强2.5 kV/cm下以不同脉冲数（50和90脉冲）进行。各提取方法的实验全因子设计见表1。

提取后，所有样品（RBP/茎秆粉末在水溶液中）使用Sorvall Legend X1R离心机（Thermo Fisher Scientific GmbH，德国）在相对离心力8000 × g下离心15 min，样品温度维持在25°C。所得上清液（甜菜色素提取物）通过Whatman 1滤纸（Sigma Aldrich，美国）真空过滤，储存于-20°C的琥珀色瓶中以待进一步分析，残留沉淀用于表面形态表征。

2.3 甜菜色素提取物的表征

2.3.1 甜菜色素含量

使用紫外-可见分光光度计（CM-3500d，Minolta，日本）在200–650 nm范围内对RBP和RBS汁液进行光谱扫描后，分别在535和480 nm处测定甜菜红素和甜菜黄素含量，计算公式如下：

甜菜红素（mg/g DM）= (A₅₃₅ × DF × MW × 1000) / (ε × L)

甜菜黄素（mg/g DM）= (A₄₈₀ × DF × MW × 1000) / (ε × L)

总甜菜色素（mg/g DM）= 甜菜红素 + 甜菜黄素

其中A为吸光度，DF为稀释因子，MW为分子量（甜菜红素550 g/mol，甜菜黄素308 g/mol），ε为摩尔消光系数（甜菜红素60,000 L/mol/cm，甜菜黄素48,000 L/mol/cm），L为光路长度（1 cm）。

2.3.2 植物化学含量与抗氧化潜力

采用 spectrophotometric 方法测定不同提取方法所得甜菜色素提取物中的总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）。TPC结果以没食子酸当量（mg GAE）/g DM表示，TFC以儿茶素当量（mg CTE）/g DM表示。此外，所有提取物进行铁还原抗氧化能力（FRAP）测定，结果以μM Trolox当量（μM TE）/g DM表示。

2.4 贮藏期间甜菜色素的降解动力学

将超声、高压和PEF辅助的甜菜色素提取物储存于琥珀色离心管中，在冷藏条件（4°C）下贮藏120天。贮藏期间，每40天测定一次甜菜色素保留率、TPC、TFC和基于还原潜力的抗氧化活性。

2.4.1 贮藏期间降解动力学建模

为确定甜菜色素含量、TPC、TFC和抗氧化活性（AOX）在120天内的降解/变化动力学级数，假设了零级（方程5）和一级（方程6）动力学模型，基于通用动力学模型（方程4）：

-dC/dt = kCⁿ

零级：C_t = C₀ - k₀t

一级：ln(C_t/C₀) = -kt

其中C₀为初始甜菜色素含量（mg/g），C_t为任意时间t的值，k₀为零级速率常数（day^?1），k为一级速率常数（day^?1），t为贮藏时间（天）。

所有属性降至原始含量一半所需的时间，即半衰期（t_1/2），计算如下：

零级：t_1/2 = C₀/(2k₀)

一级：t_1/2 = ln(2)/k

2.5 扫描电子显微镜（SEM）

使用SEM（TM3000，Hitachi，日本）观察经UAE、HPAE和PEFAE处理的样品差异。操作条件为15 kV电子功率，分析模式，自动对焦功能，放大倍数×500。

2.6 统计分析

所有测量均进行三次重复，结果以平均值±标准差表示。实验数据基于单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey HSD检验（提取方法间属性特征），以95%置信区间检验显著差异（p < 0.05）。使用JMP软件（JMP Pro，Version 15.1.0，SAS Institute Inc.，美国）进行统计分析。

3 结果与讨论

3.1 提取方法对RBP提取物中甜菜色素和植物化学含量的影响

通过HPAE、PEFAE和UAE在不同提取条件下获得的RBP提取物中的甜菜色素（甜菜红素+甜菜黄素）、TPC、TFC和AOX总结于表2。 regardless of extraction methods, the obtained betacyanin contents (6.76–10.06 mg/g DM) of RBP were significantly higher (p < 0.05) than those of betaxanthin contents (4.65–6.86 mg/g DM), which is rational as betacyanins made up 88% of betalains, whereas betaxanthins accounted for 12%. Overall, UAE was the most effective for the extraction of betalains (betacyanin + betaxanthin) and bioactive compounds from RBP, whereas PEFAE was found to have comparatively the least effect.

对于HPAE，甜菜红素、甜菜黄素、TPC和TFC的提取 yield 随压力升高而显著增加（p < 0.05），分别从7.11 mg/g DM（150 MPa）增至9.38 mg/g DM（350 MPa），从4.65 mg/g DM增至6.08 mg/g DM，从45.64 mg GAE/g DM增至68.02 mg GAE/g DM，从15.46 mg CTE/g DM增至17.98 mg CTE/g DM。这归因于 mass transfer 理论，即 mass transfer 速率取决于总压力差和 mass transfer 阻力。较高压力通过增加压力（浓度）梯度、增强目标化合物的扩散性和破坏细胞膜以提高渗透性来提升 mass transfer 速率，从而改善提取过程中溶剂向细胞的渗透。然而，在较高压力条件（350 MPa）下，压力保持时间对RBP中甜菜色素、酚类和黄酮的提取无显著差异。这可能与细胞内外压力达到平衡有关，因此 beyond 10 min at 350 MPa did not show any significant improvement in the extraction yields. 表面形态上，高压导致更多孔隙通道的形成以及微孔的扩大，从而使溶剂易于通过间隙和裂隙进入细胞，与固体相互作用并转移至溶液中。

PEF处理对RBP中甜菜色素和水溶性生物活性化合物提取的影响在场强2.5 kV/cm、处理时间50至90脉冲下进行，结果如表2所示。结果表明，较短持续时间（50脉冲）的PEF处理增加了RBP提取物中的甜菜色素（13.07 mg/g DM）和黄酮（15.91 mg CTE/g DM）。在红甜菜细胞中，甜菜色素位于液泡中，由磷脂双层包裹。该双层是内部化合物提取的主要屏障，在PEF处理期间通过 electroporation 失去其完整性，需要 transmembrane potential 的阈值。因此，本研究中较短脉冲（处理时间）的较高提取 yield 可能是由于达到了破坏RBP细胞膜完整性所需的阈值 transmembrane potential，从而增加了其渗透性，使溶剂能够渗透至内部化合物。就TPC和AOX含量而言，两种PEF条件（50和90脉冲）之间无显著差异，这也证明了这一点。

among the extraction methods, maximum pigment concentration of 16.92 ± 0.19 mg/g DM was found in ultrasound-assisted RBP extracts sonicated for 10 min. 超声处理10分钟 also extracted higher flavonoid compounds (18.49 ± 0.19 mg CTE/g DM) with maximum AOX activity that is, 112.10 ± 0.36 μM TE/g DM. 超声提取的效率归因于其 ability to disrupt the integrity of the cell membrane. 在UAE过程中，超声波在液体介质中传播产生气泡，这些气泡剧烈膨胀和破裂，称为 acoustic cavitation。当 cavitation 发生在RBP固体表面附近时，会产生微射流和微湍流，导致细胞破碎、结构破坏、侵蚀和 sonoporation 等效应，从而增强目标化合物的 mass transfer。此外， sonocavitation 有助于去除提取介质中的溶解氧，从而为甜菜色素提供额外有益效果，因为甜菜色素在氧存在下对氧化降解高度敏感。关于酚类， prolonged sonication (20 min) provided significantly higher extent of TPC (60.36 ± 0.32 mg GAE/g DM). 次级代谢物如多酚位于植物细胞的液泡、质外体和叶绿体中，常与单糖、多糖和蛋白质结合。因此， prolonged sonication 期间酚类的增加可能与 conjugated polyphenols 水解产生的可用羟基数量增加有关。然而，超声处理20分钟显示甜菜红素和甜菜黄素提取效率显著下降，这可能与温度效应相关。 elevated temperature leads to the breakdown of betalains into betalamic acid and cyclo-dioxyphenylalanine (DOPA).

3.2 提取方法对RBS提取物中甜菜色素和植物化学含量的影响

如前所述，甜菜色素提取的有效性高度依赖于植物基质的类型及其结构 disintegration 的程度，以及提取参数。为此，除RBP外，还使用RBS通过相同提取方法提取甜菜色素和酚类。结果表明， along with UAE, PEFAE was also found to be better for the extraction of betalain (betacyanin + betaxanthin) and bioactive compounds from RBS, whereas HPAE was found to have comparatively the least effect (Table 3).

压力处理延长保持时间（20分钟）有利于从RBS中最大程度提取甜菜色素（3.1 mg/g DM）、酚类（52.87 ± 0.61 mg GAE/g DM）和黄酮（22.93 ± 0.20 mg CTE/g DM）以及较高AOX（98.27 ± 1.24 μM TE/g DM），且当压力较低即150 MPa时最为明显。压力对细胞基质的应用通过创建孔隙通道扰乱其结构，使溶剂能够渗透，延长保持时间有利于溶剂和溶质保持接触更长时间，从而导致提取 yield 增加。压力辅助RBS提取物中的总甜菜色素几乎比最佳压力处理条件（350 MPa，10分钟）下RBP提取物低5倍，酚类也是如此（低1.3倍）。然而，压力辅助RBS中的黄酮含量比RBP提取物高约1.2倍，这可能与黄酮在茎秆中 against photooxidative stress 的防御机制有关，茎秆暴露在阳光下。与RBP类似，RBS的PEF处理短时间（50脉冲） gave higher extraction yield of betalains (3.15 mg/g DM), phenolics (55.23 ± 0.82 mg GAE/g DM), and flavonoids (24.41 ± 1.42 mg CTE/g DM) with appreciable AOX (95.65 ± 0.85 μM TE/g DM) activity. 这可能是由于达到了PEFAE期间 electroporation 所需的阈值 transmembrane potential。此外，PEFAE从RBS中提取色素和酚类的效率相对高于HPAE。这可能归因于 electroporation 过程的性质，该过程受细胞形状和取向等各种生物学因素的影响。就甜菜红素和甜菜黄素含量而言，处理10和20分钟的PEF辅助RBS提取物之间无显著差异。然而， prolonged sonication provided comparable phytochemical contents in RBS that again can be related to the hydrolysis of glycosylated/condensed polyphenols. 考虑到能耗和可用数据，UAE处理10分钟被认为是 from RBS提取天然色素和生物活性化合物的最佳条件。

基于上述发现，选择的RBP提取物（UAE: 300 W, 10 min; HPAE: 350 MPa, 10 min; PEFAE: 50 pulses）和RBS提取物（UAE: 300 W, 10 min; HPAE: 150 MPa, 20 min; PEFAE: 50 pulses）进一步进行贮藏稳定性分析。为观察这些提取方法在选定条件下对RBP和茎秆基质的影响，×500放大倍数下的扫描电子显微照片如图1所示。为补充提取效率数据并阐明植物细胞基质的物理破坏，对经UAE、HPAE和PEFAE在选定条件下处理的RBP和RBS样品进行SEM。SEM显微照片（图1）提供了每种提取技术 induced 细胞 disintegration 程度的视觉证据。经UAE（300 W, 10 min）处理的样品表现出严重的结构损伤，具有明显的细胞壁破裂、破碎和孔隙形成。这些效应归因于超声过程中产生的 acoustic cavitation 和微射流，它们增强了溶剂渗透和 mass transfer，从而解释了UAE处理提取物中观察到的最高甜菜色素和植物化学物质 yields。相比之下，HPAE处理的样品（RBP在350 MPa下10分钟；RBS在150 MPa下20分钟）显示出中度破坏的结构，具有可见的微孔和细胞变形。高压可能 induced 压缩应力和孔隙度，促进了生物活性物质的扩散性和提取，尽管程度不如UAE。PEFAE处理的样品（50脉冲）由于 electroporation 显示出局部膜破坏和孔隙形成，与UAE或HPAE相比 damage 较少。这与观察到的中等提取效率相关，尤其是在RBP中。总体而言，SEM图像验证了提取性能背后的机制基础，突出了UAE卓越的细胞壁 disintegration 能力，其次是HPAE和PEFAE。这些形态变化 strongly support 生化发现，并强调了结构破坏在优化红甜菜副产物生物活性物质回收中的关键作用。

最后，超声、高压和PEF辅助的RBP和RBS提取物中的甜菜色素含量在3.1至16.92 mg/g DM之间变化，其中甜菜红素是主要成分。比较使用常规方法（0.4–2.31 mg/g DM）和非常规方法（6.87 mg/g DM）从红甜菜果肉中提取的甜菜色素含量，观察到红甜菜副产物如果皮和茎秆含有显著更高的甜菜色素含量。这突出了 upcycling 红甜菜生物质（果皮和茎秆）的潜力。

3.3 RBP和RBS提取物的贮藏稳定性

selected sonicated, PEF, and pressure treated RBP and RBS提取物中甜菜色素、TPC、TFC和AOX的变化 investigated for 120 days. All the extracts (pH 4.3–4.4) were stored in amber brown bottle in refrigerated conditions. 为开发能更好描述RBP和RBS提取物中所研究属性变化的动力学模型，考虑了零级和一级动力学模型， accordingly, the obtained kinetic parameters are presented in Table 4 (RBP) and Table 5 (RBS).

3.3.1 贮藏期间颜色色素的变化

RBP和RBS提取物中的甜菜红素和甜菜黄素水平在贮藏期间显著下降（p < 0.05），其变化通过动力学建模检验。基于回归系数（R²）和均方根误差（RSME），发现一级动力学模型能显著（p < 0.05）解释两种植物基质中甜菜色素的变化，优于零级动力学（表4和表5）。 betaxanthins were more stable than betacyanins, which is in agreement with the findings of Trych et al. (2022). 这可能与甜菜红素可能转化为降解产物如 betalamic acid、neobetacyanins 和 betaxanthins 有关。

虽然比较提取方法间甜菜色素的降解速率常数（k），但发现超声辅助的RBP和RBS提取物 offered comparatively slower degradation rates of betacyanin (0.002 and 0.009 day^?1, respectively) and betaxanthin (0.003 and 0.005 day^?1, respectively). 相反，高压辅助提取物表现出 higher degradation rate constant for both types of matrices, possibly due to betalain oxidation triggered by the baro-induced increase in oxygen pressure within the sample. 超声处理的RBP和RBS提取物中甜菜红素的半衰期（t_1/2）分别为346.57和77.01天，而甜菜黄素分别为231.04和138.63天。

3.3.2 贮藏期间酚类和黄酮的变化

RBP和RBS提取物中的TPC和TFC随贮藏时间显著下降（p < 0.05）。此外，RBS提取物中总酚类的减少大于RBP提取物，而总黄酮的下降在RBP提取物中比在RBS提取物中更为明显。贮藏期间酚类的减少可能与酚类化合物的聚合或缩合有关，这降低了提取物中羟基的可用性。 rosehip nectars 中的酚类随贮藏时间和温度升高而显著下降。总酚类和黄酮的降解遵循一级动力学模型。

3.3.3 贮藏期间AOX的变化

在RBP和RBS提取物中观察到AOX活性随贮藏时间显著增加（p < 0.05）。RBP和RBS提取物中AOX活性的变化通过零级动力学模型比一级动力学模型更好地描述，如R²和RMSE值所示。 red beet juice concentrates 中AOX活性的变化在贮藏期间遵循零级动力学。红甜菜样品AOX能力的增加可能与如前所述的甜菜色素降解产物有关。 betalamic acid 和 cyclo-DOPA-5-O-glycoside 等具有AOX潜力的化合物在甜菜色素降解过程中形成，在提升抗氧化能力方面发挥作用。 pressure-assisted extracts exhibited a higher rate constant for changes in AOX activity, which could be associated with their increased betalains degradation as was seen before. 另一方面，超声处理提取物表现出相对稳定的AOX活性，如其较低的速率常数所示（RBP: 0.993 day^?1; RBS: 0.637 day^?1）。此外，发现RBP提取物的AOX增加速率常数高于RBS提取物，这可能与RBP提取物在贮藏期间TPC和TFC的较低降解速率常数有关。

总体而言，提取方法间贮藏稳定性的差异可归因于细胞破坏的程度和性质以及由此导致的敏感生物活性物质对氧、光和酶的暴露。 among the extraction methods, UAE demonstrated superior post-extraction stability of betalains and other phytochemicals, which can be attributed to several factors. 值得注意的是，超声空化不仅增强 mass transfer，还有助于去除提取介质中的溶解氧， thus reducing the oxidative stress that often drives pigment degradation during storage. 此外，UAE中相对温和的加工条件保留了化合物的结构完整性并最小化了酶活化。相比之下，HPAE可能 induce baro-oxidative stress, leading to the formation of microenvironments with increased oxygen pressure that may accelerate the degradation of pigments and phenolic compounds during storage. PEFAE则导致局部 electroporation，可能不仅促进色素释放，还促进内源氧化酶的共提取和活化， potentially compromising long-term stability. 此外，提取物中受提取方法影响的结构完整性和残留酶活性也可能在促进或抑制随时间降解方面发挥作用。这些因素共同导致了观察到的不同方法间甜菜色素和其他植物化学物质提取后稳定性的变化。这些机制性见解有助于解释观察到的降解动力学变化，并进一步支持我们的结论，即UAE是生产稳定红甜菜副产物提取物的最有效非热方法。

研究结果表明，甜菜色素随时间发生显著降解， best described by first-order kinetics, with UAE offering superior stability compared to PEF and high-pressure methods. 值得注意的是，甜菜黄素表现出比甜菜红素更高的稳定性， highlighting the need to consider pigment-specific degradation pathways in product development. 与色素和酚类下降趋势相反，AOX增加， likely due to the formation of degradation products with potent radical-scavenging properties. 通过将降解动力学整合到提取技术评估中，本研究填补了 vital knowledge gap, enabling the scientific community to move beyond yield-focused optimization and toward the development of storage-stable, functional plant-based ingredients. 该结果对食品、营养保健品和功能性饮料行业寻求在货架稳定配方中利用红甜菜副产物具有直接意义。

4 结论

尽管先前研究主要关注优化甜菜色素的提取 yields，但本研究通过评估红甜菜副产物（RBP）和茎秆（RBS）提取物中生物活性化合物（尤其是甜菜色素）的