一种利用红外基质辅助激光解吸电喷雾离子化技术实现N-连接糖类质量测量精度达到百万分之一以下的策略

《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：A Strategy to Achieve Sub-Parts-per-Million Mass Measurement Accuracy of N-Linked Glycans Using Infrared Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization

质谱校准技术优化与N-连接糖亚ppm准确度研究。采用IR-MALDESI直接分析牛胎素N-连接糖，通过自定义校准策略（外锁质量m/z1033.98810）、离子积累时间优化（90ms最佳）及双模式数据采集（ centroid为主），结合外锁质量校正技术，实现17种N-连接糖亚ppm质荷比准确度检测，空间电荷效应显著影响大分子离子积累。该方法提升糖基组学解析精度，为生物组织质谱成像（MSI）提供优化方案。

　　在生物医学研究中，准确测定大分子物质的质量对于理解其结构和功能具有重要意义。特别是对于糖类分子（glycans），其结构复杂性以及在细胞识别、信号传导、蛋白质折叠和免疫反应等过程中的关键作用，使得对糖类的高精度质量分析成为研究的重点。然而，传统的质量校准方法在面对大分子糖类时存在一定的局限性，尤其是在高分辨率准确质量（HRAM）轨道阱质谱仪（Orbitrap）上，由于空间电荷效应（space charge effects）导致的离子群体变化，常常会影响质量测量的准确性。为了克服这一挑战，本研究探索了多种校准策略和外部质量校正方法，旨在实现糖类分子的亚百万分之一（sub-ppm）级别的质量测量精度（MMA），并评估这些方法在生物组织成像（MSI）中的应用潜力。

研究中使用了红外矩阵辅助激光解吸电喷雾离子化（IR-MALDESI）技术，对从牛胎球蛋白（bovine fetuin）中裂解下来的N-连接糖类进行直接分析。通过调整离子累积时间、数据采集模式以及采用定制化的校准方案，研究人员发现优化的离子累积时间（90毫秒）能够显著提高糖类离子的累积量，从而改善信号强度和质量测量的准确性。此外，采用轮廓模式（profile mode）而非质心模式（centroid mode）有助于更全面地评估峰形和分辨率，而质心模式则因其处理算法的特性，能够集中质量测量结果，减少数据波动，从而提高数据的稳定性。

研究还发现，传统的质量校准方法在小分子分析中表现良好，但对于大分子如N-连接糖类，其质量测量精度受到限制。因此，引入定制化校准策略，尤其是选择与目标分子质量范围相匹配的外部锁质量（external lock mass），成为提高测量精度的关键。在本研究中，研究人员利用定制校准方法，将锁质量设定为1033.98810（对应于六氟磷酸盐类化合物），该质量点与N-连接糖类的质量范围高度重合，从而有效提升了整体质量测量的准确性。通过将这一锁质量作为参考点，研究人员进一步应用单点外部质量校正技术，对12种N-连接糖类进行校正，结果显示，在外部校正后，94%的糖类质量测量精度落在亚百万分之一范围内，而未经校正的样品仅有81%的测量精度达到这一标准。这表明，选择合适的外部锁质量和应用外部质量校正技术能够显著提高大分子的质量测量精度。

值得注意的是，尽管质心模式在数据采集过程中减少了信号波动，提高了数据的集中度，但轮廓模式在分析糖类分子的结构特征方面更为全面。通过对不同数据采集模式的比较，研究发现轮廓模式能够更清晰地捕捉到糖类分子的离子分布情况，尤其是在处理具有多个电荷状态的复杂糖类时，轮廓模式的优势更加明显。因此，在实际应用中，研究人员结合了质心模式的数据采集优势和轮廓模式的分辨率优势，以达到最佳的分析效果。

此外，研究还揭示了外部质量校正对糖类分子质量测量精度的深远影响。通过使用特定的锁质量作为校正参考，研究人员不仅提高了整体的质量测量精度，还确保了在不同质量范围内的糖类分子都能获得一致的校正效果。这一方法的实施，使得糖类分子的质量测量误差显著降低，为糖类的准确鉴定提供了坚实的基础。更重要的是，这种校正方法不仅仅适用于N-连接糖类，还能够推广到其他大型生物分子，如O-连接糖类、糖基鞘脂衍生糖类和自由寡糖等，从而提升整个生物分子质量分析的可靠性。

本研究的成果对于生物医学领域具有重要的实际意义。通过优化离子累积时间、数据采集模式和外部质量校正方法，研究人员成功实现了N-连接糖类的亚百万分之一质量测量精度。这不仅有助于更准确地解析糖类的结构信息，还能够提高对糖类在生物组织中的分布特征的理解。在生物组织成像中，准确的质量测量对于识别特定的糖类分子及其在组织中的空间分布至关重要，能够为疾病机制研究、药物开发和生物标志物发现提供关键的数据支持。

研究过程中，实验数据的处理和分析采用了多种软件工具，包括Thermo Scientific XCalibur、MSConvert、imzMLConverter和MSiReader等，这些工具在数据转换、校正和可视化方面发挥了重要作用。通过将原始数据转换为标准格式（如.mzML和.imzML），研究人员能够更高效地进行数据分析，并利用统计方法评估不同参数对质量测量精度的影响。同时，研究还强调了质量测量精度的可重复性和稳定性，特别是在没有自动增益控制（AGC）的情况下，如何通过优化离子累积时间和校准策略来实现高质量的测量结果。

从实验结果来看，采用外部锁质量和单点校正方法，不仅提高了N-连接糖类的质量测量精度，还增强了数据的可解释性。研究人员通过绘制质量测量误差（MMA）与质量差值（delta m/z）之间的关系图，进一步验证了选择合适的锁质量对于提高测量精度的重要性。这种分析方法为未来在高分辨率质谱仪上进行大分子质量测量提供了新的思路和技术路径。

本研究的发现表明，质量校准和外部质量校正策略在高精度质量分析中具有不可替代的作用。特别是在处理具有复杂结构和高质量数的生物分子时，传统的校准方法往往难以满足精度要求，而定制化的校准方案则能够有效克服这一问题。通过优化这些策略，研究人员不仅提高了N-连接糖类的质量测量精度，还为其他大型生物分子的分析提供了可行的解决方案。这不仅对糖类研究领域具有重要意义，也为更广泛的生物医学研究奠定了技术基础。

综上所述，本研究通过系统分析和实验验证，提出了实现N-连接糖类亚百万分之一质量测量精度的有效方法。这些方法包括优化离子累积时间、选择合适的外部锁质量以及采用轮廓和质心模式相结合的数据采集策略。研究结果表明，这些策略的综合应用能够显著提高质量测量的准确性，减少误差，并增强对复杂生物分子的分析能力。随着生物医学研究的不断深入，对大分子质量的精确测量将成为理解其功能和机制的重要手段，而本研究提供的解决方案则为这一目标的实现提供了有力的技术支持。未来，这些方法有望在更多生物医学应用中得到推广和使用，从而推动相关研究的发展。