儿童急性淋巴细胞白血病分子诊断新突破：多组学技术联合应用显著提升诊断精准度与临床分层价值

本研究针对儿童急性淋巴细胞白血病(pALL)分子诊断中标准方法(SoC)灵敏度与分辨率不足的问题，系统评估了光学基因组图谱(OGM)、数字化多重连接探针扩增(dMLPA)、RNA测序(RNA-seq)和靶向二代测序(t-NGS)等新兴基因组技术的临床应用价值。研究发现：OGM作为独立检测可识别90%病例的临床相关变异，dMLPA与RNA-seq联合策略更将检出率提升至95%，显著优于传统方法的46.7%。该研究为优化pALL分子分型流程提供了关键证据，对推动精准诊疗具有重要意义。

　　

在儿童恶性肿瘤中，急性淋巴细胞白血病（ALL）占据首位，其本质是淋巴祖细胞的失控增殖。这种疾病的遗传背景高度异质，包含大量结构变异（SVs）和单核苷酸变异（SNVs），这些变异在白血病发生过程中起着关键作用。值得注意的是，与成人病例相比，儿童ALL（pALL）中染色体重排、缺失和拷贝数变异（CNAs）等结构变异更为丰富。这些遗传异常定义了不同的分子亚型，对预测预后和治疗反应至关重要。

随着世界卫生组织（WHO）和国际共识分类（ICC）的最新更新，分子改变在定义白血病亚型中的作用日益凸显。例如，IKZF1 N159Y和PAX5 P80R等SNV定义的实体首次被纳入分类体系。同时，现代治疗方案（如ALLTogether consortium指南）已实施基于融合基因和CNA分析的风险分层策略，并对ABL类患者使用靶向抑制剂及免疫疗法。这些进展凸显了诊断实体的异质性，因此需要结合多种基因组学方法进行精确分子特征分析，以超越当前标准诊疗（SoC）方法的能力。

传统上，ALL的遗传诊断依赖于常规细胞遗传学技术，包括染色体条带分析（CBA）和荧光原位杂交（FISH）。虽然这些方法在检测 recurrent 染色体异常方面发挥了重要作用，但它们存在显著局限性，如分辨率低、对隐匿性改变的检测能力有限以及依赖可分裂中期细胞。为克服这些限制，新兴方法如多重连接探针扩增（MLPA）、靶向二代测序（t-NGS）、数字化多重连接探针扩增（dMLPA）、RNA测序（RNA-seq）和光学基因组图谱（OGM）已逐步应用于诊断流程，提供更高的灵敏度和更广泛的检测能力。

尽管这些新技术具有改进潜力，但每种方法在检测特定类型遗传改变方面都有其内在的优缺点。迄今为止，尚无单一方法能够全面覆盖ALL的整个突变谱，导致临床实践中的最佳诊断策略仍未解决。需要对这些方法进行系统评估，以确定在临床环境中实现准确高效诊断的最有效途径。

本研究采用标准诊疗方法、OGM、t-NGS、MLPA、dMLPA和RNA-seq（当有足够遗传材料时）对60例pALL患者进行了分析。主要目的是评估每种方法的诊断效能，包括单独使用和组合使用，以确定在临床环境中对pALL进行全面基因组特征分析的最稳健策略。迄今为止，该队列代表了在单一机构内通过OGM进行临床特征分析的最大pALL系列，为该疾病的最佳诊断流程提供了宝贵见解。

主要技术方法包括：使用商业探针通过FISH检测 recurrent 融合基因；通过MLPA和dMLPA分析拷贝数变异；通过OGM检测结构变异和全染色体异常；通过t-NGS panel（ALLseq）检测SNV/Indel、CNAs和融合基因；通过RNA-seq（20例样本）进行融合基因检测和基因表达谱分析。所有分析均遵循标准化实验流程和生物信息学分析方法。

结构变异

染色体增益和缺失

dMLPA共识别出191个全染色体增益和14个缺失，平均每位患者2.55个改变。76.6%的这些改变发生在16例超二倍体核型患者中，涉及5-9条染色体。最常增加的染色体是21、14、10、X、4、17和6，其中21号、X、4号和8号染色体存在 recurrent 多拷贝。OGM与dMLPA显示完全一致性，两者均比SoC方法多识别出5例超二倍体病例。

拷贝数变异

MLPA分析显示队列中共有79个亚染色体CNA，平均每位患者1.3个改变。最常改变的基因是CDKN2B（27/60, 45%）和CDKN2A（25/60, 41.7%）。dMLPA与MLPA在CNA-UKALL分析上完全一致，并在37/60（61.7%）患者中识别出207个额外的亚染色体改变。最常见的是MTAP（11/60, 18.3%）和MLLT3缺失（18/60, 30%），两者均作为9p21缺失的一部分出现。OGM与MLPA和dMLPA在55/60（91.7%）患者中对CNA-UKALL显示完全一致，但在5例病例中存在差异，主要影响CDKN2A/B和PAR1区域。

融合基因

t-NGS共识别出18例融合基因，涉及18/60（30%）患者。最常见的是ETV6::RUNX1（7/18, 38.9%），其次是P2RY8::CRLF2（4/18, 22.2%）。OGM检测到34/60（56.7%）患者中的37个融合，显著多于t-NGS，并提供了PAX5重排的更广泛特征。RNA-seq在20例患者中检测到21个融合，涉及16例患者，检出率高于t-NGS，并唯一识别出IGH::DUX4（n=2）、IGH::CEBPE和IGH::EPOR融合。

SNV/Indels

t-NGS在52/60（86.7%）患者中识别出80个SNV/Indel，中位数为每位患者1.5个改变。大多数变异是错义突变（62/80, 77.5%）。涉及RAS信号通路的基因是最常改变的，NRAS（23%）、KRAS（21%）和FLT3（13%）是最常受影响的基因。值得注意的是，这些突变中有相当一部分是在亚克隆水平检测到的，表明白血病存在多个亚群。

遗传改变与白血病亚型的关联

完整遗传图谱与人口统计学数据共同分析显示，IGHM和ERG缺失的共突变与DUX4重排显著相关（p=0.012）。IGHM缺失作为单一事件与Pre-B表型强相关，而仅在一例常见B细胞表型患者中检测到。JAK2缺失在PAX5改变亚组中显著富集（p=0.016），而IKZF1缺失和NRAS突变分别主要与iAMP21（p=0.03）和BCR-ABL样/JAK-STAT激活病例（p=0.04）相关。

新兴技术的诊断效能

每种技术的诊断效能因分析的遗传改变类型而异。对于染色体增益和缺失，OGM和dMLPA识别出最高数量的事件（31/60, 51.7%），临床效用优于SoC方法（61.3% vs. 66.7%）。CNA-UKALL评估显示MLPA和dMLPA完全一致，在近三分之二队列（38/60, 63.3%）中检测到改变，临床相关性100%，而OGM灵敏度稍低，在36/60（60%）患者中检测到改变。相反，UKALL-CNA风险 panel 外的CNA通过dMLPA和OGM检测灵敏度相似（37-38/60），但仅一小部分具有临床相关性（约5%）。

最显著差异出现在融合基因检测。SoC方法和t-NGS在30%患者（18/60）中识别出融合，临床相关性率分别为72.2%和100%。相比之下，OGM和RNAseq在显著更高比例患者中检测到融合（56.7%和80%, p<0.01），临床相关性率分别为76.5%和81.3%。SNV和indel仅通过t-NGS检测（52/60），但均无当前临床相关性。

一致性分析显示某些技术间存在显著差异。对于染色体增益和缺失，SoC方法在9/60（15%）患者中存在差异，主要由于非信息性病例，而OGM和dMLPA显示完全一致。对于CNA-UKALL风险评估，MLPA和dMLPA完全一致，而OGM在1/60（1.7%）病例中显示部分一致，在4/60（6.7%）患者中不一致。关于其他CNA，60%患者实现完全一致，38.3%部分一致，主要由于dMLPA未覆盖区域。仅一例（1.7%）观察到差异，dMLPA检测到ERG缺失而OGM遗漏。对于融合基因，OGM和RNAseq间观察到最高一致性（完全和部分），仅10%患者显示差异，主要由于OGM遗漏IGH重排。相反，t-NGS-RNA和RNAseq间差异最大，65%患者不一致，由于这些技术检测能力差异。

新兴技术改善分子诊断和风险分层的潜力针对SoC方法和临床常用各种技术组合进行了评估。OGM作为独立测试在细化B-NOS和T-NOS病例方面表现显著优于SoC方法（25% vs. 40%, 和3.3% vs. 13.3%, p<0.01）和tNGS（25% vs. 55%, p<0.001）。OGM在检测PAX5改变方面也优于SoC方法（0% vs. 10%, p<0.01），并提供比组合方法（包括SoC和t-NGS或dMLPA和t-NGS）更准确的诊断。此外，在20/60患者中的RNAseq评估显示，由于识别IGH重排，对B-NOS组的细化优于OGM。

在风险分层方面，OGM和dMLPA与t-NGS组合优于SoC方法与MLPA以及SoC与MLPA和t-NGS组合，特别是在良好遗传风险亚组（58% vs. 50%, p<0.05）。

总体而言，OGM和RNAseq在识别临床相关生物标志物方面优于SoC方法和常用组合方法。SoC方法表现出最低诊断效能，仅在46.7%患者中检测到临床相关生物标志物，而SoC与t-NGS组合略微提高至53.3%。相反，RNAseq和OGM作为独立方法，分别在16/20（80%）和54/60（90%）患者中检测到生物标志物。dMLPA和RNAseq组合表现最高，在95%病例中识别临床相关生物标志物。这些发现强调OGM作为强大独立工具，并突出dMLPA与RNAseq或OGM组合作为临床实践最有前景的方法。

研究结论与意义

本研究代表了通过OGM分析的最大pALL患者队列，与标准诊疗方法和新兴技术进行比较，在临床实验室环境的单一机构内进行。虽然这些技术的分析性能已被不同团队报道，但这是首次在同一队列中评估它们作为独立方法和组合的诊断效能的研究。我们的结果支持将OGM或dMLPA与RNAseq组合纳入临床实践，因为这些方法将具有临床相关标志物的患者比例显著提高至90-95%，而使用标准诊疗方法仅为46.7%。这种改进具有直接临床意义，因为诊断和/或风险分层的细化可能影响治疗决策，包括靶向治疗资格或临床试验入组，这可能显著影响这些患者的生存。

基于CBA的细胞遗传学分析长期以来一直是检测pALL中染色体增益和缺失的金标准。这些改变出现在高达35-40%的病例中，对预后和治疗决策至关重要。最近的研究证明了OGM和dMLPA等新方法的高分辨率和灵敏度，我们的发现进一步强化了这些观察结果，显示非信息性病例显著减少，并且仅考虑染色体增益和缺失就重新分类了8.3%的患者。

亚染色体改变近年来日益受到认可，特别是那些包含在UKALL-CNA风险谱中的改变，已证明具有预后意义，现在临床实验室中必须检测。由于CBA分辨率有限，MLPA被推荐作为识别这些改变的金标准。与Bedics等人的研究一致，我们的数据也支持dMLPA作为检测这些改变的可行替代方案，显示与MLPA可比的结果，这鉴于它们共享方法学原理是预期的。相反，OGM在8.3%病例中显示不一致结果，主要影响CDKN2A/B和PAR1区域。对这些差异的合理解释可能是OGM在某些基因组区域的内在局限性。与测序-based技术类似，OGM在低覆盖区域和高度重复序列（如伪常染色体区域PAR）中表现出降低的灵敏度，这可能影响特定CNA的检测。此外，OGM对CNA的检测限是另一个关键因素。Levy等人报道，最小覆盖300x可确保10%-15% VAF的可靠检测限；然而，在覆盖较低的样本中，该阈值急剧下降，进一步影响灵敏度。

UKALL-CNA谱之外的CNA目前临床意义有限。然而，某些改变如ERG缺失已整合到IKZF1plus风险谱中，并被一些团队用于风险分层。此外，我们识别了 recurrent VPREB1缺失，这是一个对淋巴发育至关重要的基因，其缺失可能导致早期阶段成熟停滞。类似地，IGHM缺失可能损害功能性BCR的形成，也导致前B阶段发育阻滞，并可能有助于白血病转化。有趣的是，作为单一事件的IGHM缺失与前B表型强相关，而IGHM和ERG的共突变与IGH::DUX4和常见B表型相关。这些发现支持了以下假设：IGHM缺失在某些情况下可能作为IGH融合的替代标志物，并通过破坏早期B细胞受体形成和与DUX4驱动的转录程序合作而有助于白血病发生。因此，尽管UKALL-CNA谱之外的大多数CNA目前不被认为具有临床相关性，但它们的识别可能有用，因为它们可能对pALL分类和风险评估具有未来意义。

产生基因融合的结构变异是pALL的一个标志，当前诊断指南要求临床环境中识别超过10种 recurrent 重排。t-NGS十年前作为核型和FISH的更全面替代方案出现，现已广泛应用于临床实验室。然而，pALL中仅约30%的融合是 recurrent 的，这对t-NGS-RNA panel 构成了重大挑战，这些 panel 本质上仅限于检测已知靶点。这一局限性在我们的结果和他人的报告中都很明显，虽然我们队列中t-NGS-RNA检测到的所有融合都具有临床相关性；但OGM或RNAseq识别的重排数量显著更高，强调了无偏全基因组方法在pALL分子特征分析中的价值。此外，大量pALL亚型现在通过GEP而非单一遗传改变定义。鉴于这些实体在患者管理中的关键作用以及RNAseq日益增加的可负担性，该技术正在成为临床实践中从t-NGS-RNA逻辑过渡的工具。另一个可以解决的重要挑战是定位在高度重复或可变区域（如IGH::DUX4或IGH::CEBPE）的复杂融合的识别，大多数技术在此经常失败。将融合调用与基因表达谱分析整合的能力增强了检测这些改变的稳健性。事实上，RNAseq是唯一识别4例携带IGH重排患者的技术，这些重排被任何其他方法遗漏，进一步支持其作为pALL分子诊断强大工具的作用。关于OGM，它能够检测可能不导致融合转录本形成的复杂结构变异。这在T-ALL中特别相关，其中非典型或转录沉默重排可能出现在高达60%的病例中。

与成人ALL和其他血液肿瘤不同，其中诊断分类、治疗方案和临床试验日益将SNV纳入临床决策，当前pALL治疗指南（如ALLTogether方案）不考虑这些改变用于治疗分层。尽管某些SNV对诊断分类仍然相关——特别是在ICC 2022框架下——所有这些实体也以 distinct 转录特征为特点。因此，当转录组分析可用时，识别潜在点突变可能不是必需的。此外，当达到足够读长时，RNA-based方法也可以检测SNV/indel，进一步减少单独靶向测序的需求。与此一致，我们的结果显示，虽然超过85%患者携带至少一个SNV/indel，但绝大多数在当前儿科环境中缺乏临床相关性。因此，主要专注于检测SNV/indel的基因组学方法，如靶向NGS panel，可能对pALL临床环境的效用有限。

尽管我们的研究具有优势，包括使用多种方法对pALL进行全面遗传特征分析，但应承认一些局限性。由于研究在单一机构进行，这些发现的适用性可能因中心而异，取决于当地基础设施和专业知识。此外，队列规模相对适中，可能限制检测涉及罕见改变或特定亚型关联的统计效力。低原始细胞百分比样本可能被假定为误诊，无论使用何种方法。然而，pALL诊断或复发时低原始细胞计数是不常见的。关于罕见实体的潜在误分类，GEP已被证明可准确检测多达21种B-ALL亚型和10种T-ALL类别，这保证了罕见实体的识别，特别是在B-ALL中。T-ALL中 intergenic 融合很常见，并且这些改变已被广泛证明可通过OGM正确检测。因此，我们工作中未包含的罕见实体应通过这些技术正确识别。尽管如此，需要额外研究验证我们的结果并评估更广泛实施这些策略的可行性。

总之，本研究证明了新兴技术在改善儿童ALL分子特征分析方面的价值。大规模多中心研究为定义该疾病的分子基础铺平了道路，提供了对其遗传景观的关键见解。然而，必须将这些不断增长的知识转化为可访问且可行的诊断流程，以便在常规临床环境中实施。本研究验证了OGM等新技术，评估了它们的个体和组合性能，并最终提出了基于OGM作为独立方法或RNAseq与dMLPA组合的诊断策略。两种策略均显著增加临床相关改变的检测，并可通过减少级联测试需求简化当前诊断算法，这通常导致成本增加和周转时间延长，与现实世界诊断实验室的需求不符。这种技术适应将确保更全面的诊断，促进治疗决策，并最终改善患者结局。