植物半胱氨酸氧化酶4（AtPCO4）活性增强构象变化的证据：底物或底物模拟物结合诱导的构象转变

本文推荐植物缺氧感应关键酶——植物半胱氨酸氧化酶（PCO）的研究。为提升作物耐涝性，研究人员设计了一系列ERF-VII转录因子来源的拟肽分子，意外发现其能增强而非抑制AtPCO4活性。氢氘交换质谱（HDX-MS）显示拟肽结合诱导酶构象变化，首次揭示PCO存在"构象启动"机制，为植物洪水胁迫响应机制提供了新见解。

　　

当洪水来袭，植物会面临缺氧的严峻挑战。为了应对这种逆境，植物演化出了一套精细的氧感应机制，其核心是一种名为植物半胱氨酸氧化酶（PCO）的酶家族。在正常氧气条件下（常氧），PCOs利用氧气催化第七组乙烯响应因子（ERF-VIIs）的N端半胱氨酸氧化，启动其降解途径，从而抑制缺氧响应基因的表达。而当缺氧发生时，PCOs活性降低，ERF-VIIs得以稳定，进而启动一系列适应性基因表达，帮助植物生存。因此，PCOs被认为是提高植物耐涝性的重要靶点。以往的研究策略多集中于抑制PCO活性以提前启动植物的缺氧适应能力。然而，在这项发表于《Journal of Biomechanics》的研究中，牛津大学的研究团队在探索肽类抑制剂时，却意外地发现了一条全新的调控通路。

为了开发能够特异性抑制AtPCO4的肽类抑制剂，研究人员设计并合成了13种拟肽分子。这些拟肽模拟了AtPCO4的天然底物——转录因子RAP2.12的N端序列（第2至15位氨基酸），但其N端半胱氨酸被各种半胱氨酸类似物所取代，例如D-型半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺等。他们预期这些与底物结构相似的拟肽能够竞争性地结合AtPCO4的活性中心，从而抑制其催化活性。

然而，体外酶活测试的结果出乎意料。与预期相反，所有测试的拟肽分子非但没有抑制AtPCO4的活性，反而显著增强了其氧化底物RAP2.12_2-17的能力，增强幅度在2.51至5.96倍之间。这一现象并非简单的非特异性肽类稳定效应，因为使用序列无关的对照肽则无法观察到类似的增强效果。进一步实验表明，这种活性增强效应依赖于拟肽与AtPCO4的预孵育过程。如果酶与拟肽同时与底物混合，而不经过预孵育，则增强效应大大减弱。更有趣的是，研究人员发现，即使在无氧条件下预孵育AtPCO4与其天然底物RAP2.12本身，也能在后续恢复有氧条件时诱导类似的活性增强，且增强程度与预孵育时底物的浓度相关。这表明，这种"启动"效应是底物及底物类似物所共有的特性。

为了探究其分子机制，研究人员采用了计算对接和氢氘交换质谱（HDX-MS）等关键技术方法。研究主要依赖于重组AtPCO4蛋白的体外活性分析，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量监测底物肽的氧化。关键实验技术包括：拟肽分子的固相合成、酶动力学时间进程分析、在厌氧手套箱中进行的缺氧预孵育实验、基于HADDOCK平台的分子对接模拟，以及用于探测蛋白质构象动态变化的氢氘交换质谱（HDX-MS）分析。

Peptidomimetics enhance AtPCO4 specific activity towards RAP2.12_2—17

研究人员首先证实这些拟肽本身并非AtPCO4的底物，不会被酶氧化。随后进行的抑制筛选中，他们意外地发现，在高浓度拟肽（相对于底物为10:1）存在下，AtPCO4对RAP2.12_2—17的催化活性不仅没有被抑制，反而被显著增强。不同N端修饰的拟肽均能引起增强，但程度有所不同，提示其共同的核心序列是诱导增强效应的关键。

The substrate-like nature of peptidomimetics leads to priming of AtPCO4 during the preincubation period

通过使用序列无关的对照肽进行实验，研究人员排除了高浓度肽对酶的一般性稳定效应。关键实验表明，移除拟肽与AtPCO4的预孵育步骤会显著削弱活性增强效应，证明预孵育过程中的结合是"启动"酶活性的必要条件。

Dependency of AtPCO4 priming on RAP2.12_2—17 and its co-substrate, O₂

为了探究氧气是否参与"启动"过程，实验在厌氧条件下进行预孵育。结果显示，即使在无氧环境下预孵育AtPCO4与拟肽，在后续暴露于氧气时仍能观察到活性增强，表明这一 priming 过程不直接由氧气介导。更重要的是，实验发现厌氧预孵育AtPCO4与其天然底物RAP2.12本身，也能在恢复有氧后增强酶活性，且增强幅度与预孵育底物浓度正相关。

Peptidomimetic binding mimics substrate binding in the substrate binding channel

分子对接模拟预测，无论是天然底物RAP2.12片段还是拟肽分子，都倾向于结合在AtPCO4的推测底物结合通道内，而非别构位点。它们的结合模式高度相似，N端残基与活性中心的铁离子以及关键氨基酸Asp176和Tyr182存在相互作用。对接结果还提示，结合事件可能涉及一个被称为"发夹环"的柔性区域。

A hairpin loop region in AtPCO4 is involved in peptidomimetic-induced priming

为了验证发夹环区域的重要性，研究人员构建了一个AtPCO4的环区变异体，将其发夹环序列替换为人源ADO（HsADO）的对应序列。实验发现，该变异体虽然仍保有基础酶活，但其活性被拟肽增强的幅度（1.49倍）远低于野生型酶（3.61倍），表明AtPCO4特有的发夹环区域在介导拟肽诱导的活性增强中扮演着关键角色。

Incubation with peptidomimetics may shift AtPCO4 to a more active conformation

最有力的证据来自氢氘交换质谱（HDX-MS）分析。该技术通过监测蛋白质主链酰胺氢与氘水的交换速率来反映蛋白质的构象动态和溶剂可及性。比较经拟肽预孵育与未经预孵育的AtPCO4的HDX图谱，研究人员发现了显著差异。结果显示，在拟肽存在下，包含发夹环（残基176-193）在内的一个区域氘摄取减少，表明该区域变得更为"保护"，可能源于拟肽的直接结合。而与之相邻的两个环区（残基147-175和194-210）的氘摄取则增加，表明这些区域变得更为"开放"或灵活。特别值得注意的是，147-175区域靠近推测的氧气进入通道，其构象变化可能有利于氧气更有效地进入活性中心。这些HDX-MS数据清晰地表明，拟肽的结合诱导了AtPCO4发生特定的构象重排，从一个活性较低的构象转变为活性更高的构象。

综上所述，本研究最初旨在开发AtPCO4的肽类抑制剂，却意外发现底物及底物模拟肽能够通过非反应性结合诱导AtPCO4发生构象变化，从而"启动"或增强其催化活性。这种效应不依赖于氧气，但需要预结合过程，并且与AtPCO4特有的发夹环区域密切相关。HDX-MS实验为这种"构象启动"机制提供了直接的实验证据。研究人员将这种现象归因于正协同效应，即底物或底物类似物的初始结合改变了酶的结构，使其对后续底物分子的催化效率更高。

这项研究的意义在于，它首次为PCO酶的动态构象运动提供了实验证据，揭示了一种此前未知的酶活性调控机制。从生理角度思考，在植物遭遇洪水缺氧时，ERF-VII转录因子会积累，它们可能与PCO发生非反应性结合（因缺氧缺乏氧气底物），从而将PCO"启动"到高活性状态。当洪水退去，氧气恢复时，处于"启动"状态的PCO能够更快速地降解ERF-VIIs，从而使植物迅速从缺氧应激状态恢复正常代谢，这可能对植物在洪水后的恢复至关重要。这一发现不仅增进了我们对植物氧感应机制基础生物学的理解，也为未来通过理性设计改造PCO酶的特性（例如其氧敏感性或底物特异性），以培育更具耐涝性的作物品种提供了新的思路和靶点。