厌氧氨氧化肼合酶机制的光谱学研究揭示其独特催化中心的氧化还原特性与反应路径

本研究针对厌氧氨氧化细菌中关键的肼合酶(HZS)催化机制尚不明确的问题，通过结合电化学诱导的光谱学、红外差示光谱及电子顺磁共振技术，揭示了其四个血红素的氧化还原特性及配位环境，首次证实催化中心血红素αI不可还原的特性，并发现血红素γI存在多种自旋态及NO结合能力，为理解这一独特氮循环酶的反应机制提供了关键实验依据。

　　

在自然界和工程化生态系统中广泛存在的厌氧氨氧化细菌，通过将铵离子和亚硝酸盐转化为氮气，在全球氮循环中扮演着至关重要的角色。这一独特代谢过程的核心在于肼（N₂H₄）作为自由中间体的生成，而负责催化其合成的肼合酶（Hydrazine Synthase, HZS）则成为理解该生物能量转化过程的关键。尽管基于晶体结构的研究提出了初步的反应机制假说，认为一氧化氮（NO）先在血红素γI位点被还原为羟胺（NH₂OH），随后与铵在血红素αI位点缩合形成肼，但这一机制缺乏直接的实验证据支持，特别是关于各个血红素辅因子的氧化还原特性、自旋状态及其在催化过程中的具体作用仍不清楚。

为了深入解析HZS的分子机制，来自荷兰拉德堡德大学的研究团队在《Journal of Biomechanics》上发表了他们的最新研究成果。他们采用了一种严格的厌氧纯化流程以保持酶的天然性质，并综合运用了电化学诱导的紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外差示光谱（FTIR）和电子顺磁共振（EPR）等多种光谱学技术，对来源于模式菌株Kuenenia stuttgartiensis的HZS进行了系统表征。研究中所用的酶样品直接从天然菌株中纯化获得，确保了研究对象的生物学相关性。

研究的关键技术方法主要包括：在严格厌氧条件下对HZS进行多步色谱纯化；利用光学透明薄层电化学（OTTLE）细胞进行氧化还原滴定，以测定各个血红素的 midpoint potentials（中点电位）；通过X波段EPR光谱在低温（25K和60K）下检测血红素的自旋状态及NO结合情况；采用电化学诱导的FTIR差示光谱在H₂O和D₂O环境中探测血红素还原伴随的质子化事件及蛋白质构象变化。这些方法的联用使得研究人员能够从电子传递、质子耦合、配体环境等多个维度对HZS进行剖析。

UV-Vis spectroscopy

研究发现，HZS在分离状态下呈现典型的氧化型血红素c光谱。通过连二亚硫酸钠还原，其光谱变化呈现出时间依赖性，初步还原阶段（dith red 1）出现了548.5 nm和554.5 nm的双峰α带，表明α亚单元中的血红素被还原；进一步还原（dith red 2）后，在553.5 nm出现单一α带，并在430 nm出现肩峰，同时620 nm处的电荷转移带强度显著下降，这些特征指向γ亚单元中高铁自旋血红素的还原。对分离的α亚单元的研究证实，其还原光谱与全酶初步还原状态高度相似，且其高铁自旋血红素在连二亚硫酸钠存在下仍保持氧化状态。

EPR spectroscopy

EPR光谱揭示了“as isolated”的HZS中存在多种信号：略微菱形的畸变信号（g_z=6.29, g_y=5.65）和轴向信号（g=6）归属于高铁自旋血红素；两个高度各向异性的低自旋信号（HALS1: g_z=3.08；HALS2: g_z=3.46）根据其配体平面夹角的不同，分别被指认为血红素αII和γII；此外，在g≈2处观察到的具有17 G超精细分裂的信号，被证实是NO作为第五配体与还原态血红素铁（Fe(II)）结合所形成的加合物。定量分析表明，约30-35%的酶分子在纯化过程中即捕获了NO。重要的是，研究发现血红素αI呈现出不可还原的菱形高铁自旋信号，即使施加-610 mV的电位或使用连二亚硫酸钠也无法使其还原。

Optical redox titration

光学氧化还原滴定结果表明，HZS中的四个血红素具有截然不同的氧化还原电位。两个低电位血红素（αII和γII）的 midpoint potentials 约为-330 mV（vs SHE），而高电位血红素γI的氧化还原反应发生在约0 mV附近，但其光谱特征和 midpoint potentials 在不同pH条件和氧化还原循环中表现出可变性，暗示其可能存在多种构象或自旋状态。血红素αI则始终无法被还原。

FTIR difference spectroscopy

FTIR差示光谱为理解血红素还原过程中的分子事件提供了更深层次的见解。在对应于血红素γI还原的电位范围内（-210 mV 至 +390 mV），观察到1735 cm^-1处的正峰和1580 cm^-1处的负峰，这被解释为伴随着血红素还原，一个羧酸盐基团（COO^-）发生了质子化，转变为羧酸（COOH）。结合结构分析，该基团可能是与血红素γI轴向水分子形成氢键作用的Asp168或与血红素丙酸基相互作用的Glu122。在低电位范围（-210 mV 至 -560 mV）的光谱中，研究人员成功区分了血红素γII和αII的贡献，发现了与组氨酸轴向配体（ν(C₅-N₁) ring mode，~1100 cm^-1）以及精氨酸侧链与血红素丙酸基相互作用相关的特征谱带。

综上所述，本研究通过对HZS全面而深入的光谱学表征，得出了几个颠覆以往认知的关键结论：1）催化羟胺与铵缩合反应的血红素αI具有极低的氧化还原电位，在生理条件下可能始终处于氧化状态进行催化，这与之前DFT计算所推测的还原态为活性状态的观点相左；2）负责NO还原的血红素γI具有复杂的行为，其 midpoint potential 约0 mV，并能以多种自旋状态存在，同时具备结合NO的能力，其还原过程还伴随着一个天冬氨酸或谷氨酸残基的质子化，这可能为NO还原成羟胺提供质子；3）研究还详细表征了电子传递血红素γII和αII的氧化还原特性。这些发现不仅为修正和完善HZS的催化机制模型提供了至关重要的实验证据，深化了对这一独特生物能量转化过程的理解，而且对旨在优化厌氧氨氧化工艺、提升废水处理效率和解析全球氮循环的生物地球化学过程具有重要的指导意义。