上皮细胞新型GREM1内吞途径的发现：BMP结合依赖性的胞吞机制及其在信号调控中的意义

本研究发现上皮细胞中存在一种新型GREM1内吞途径，该过程依赖BMP结合，涉及网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用，并需要细胞膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖参与。研究人员通过体内外实验证明GREM1由肠道成纤维细胞分泌后被邻近上皮细胞内化，且BMP2可显著增强该过程。这一发现揭示了GREM1拮抗BMP信号的新机制，为相关发育异常和肿瘤疾病的治疗提供了新靶点。

　　

在生命科学领域，骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）信号通路的调控机制一直是研究热点。BMPs在胚胎发育、组织稳态和疾病发生中起着关键作用，而它们的活性受到多种拮抗剂的精密调控。Gremlin1（GREM1）作为BMP的分泌型糖蛋白拮抗剂，通过结合BMP2/4等配体，阻止其与受体相互作用，从而抑制BMP信号传导。然而，GREM1的生物学功能远不止于此——近年研究表明，它可能直接与受体酪氨酸激酶（如VEGFR2、EGFR和FGFR1）结合，激活非经典信号通路，这使GREM1的生物学角色变得复杂且充满争议。尤其在癌症领域，GREM1的表达异常与多种肿瘤进展相关，但其具体机制尚未明确。

长期以来，科学家们对GREM1的胞内命运知之甚少。它是否会被细胞摄取？如果会，这一过程是否影响其功能？这些问题对理解GREM1在疾病中的作用至关重要。在此背景下，研究人员开展了系统性研究，旨在揭示GREM1的上皮细胞内吞机制及其功能意义。该研究最终发表于《Journal of Biomechanics》，为相关领域提供了新的理论依据。

为开展本研究，作者运用了多种关键技术方法：包括免疫组织化学和原位杂交技术分析小鼠肠道组织中GREM1的mRNA和蛋白表达定位；采用荧光标记GREM1（FITC和mCherry融合蛋白）并通过活细胞成像、共聚焦显微镜及流式细胞术追踪其内吞过程；利用肝素酶III处理和PNGase去糖基化实验探究硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）和糖基化修饰的作用；通过酸洗脱实验区分膜结合与内化蛋白；构建BMP结合缺陷型GREM1突变体（F125A/I127A/F138A），并采用Western blot和荧光报告基因实验验证其功能；使用AKP转基因小鼠（Apc^fl/fl;Kras^Lsl-G12D;Tp53^fl/fl;villin-CreERT2）模型研究结直肠癌中GREM1的表达变化。

研究结果

Differential pattern of GREM1 mRNA and protein expression in healthy and colorectal cancer intestine

通过野生型和GREM1基因敲除小鼠结肠组织的对比，研究发现GREM1 mRNA主要表达于肠道肌层和黏膜下层成纤维细胞，而上皮细胞中几乎检测不到。然而，GREM1蛋白却在隐窝基底上皮细胞、肌层和黏膜下层均有分布。在结直肠癌模型（AKP小鼠）中，GREM1蛋白在肿瘤细胞中表达显著上调，且定位于上皮细胞的基底外侧膜。这一结果提示GREM1可能由基质细胞分泌后被上皮细胞内化。

GREM1 is internalized by HeLa cells

使用荧光标记的GREM1（GREM1-FITC）处理HeLa和HCT116细胞，发现短时间内（60分钟）GREM1主要结合于细胞膜，而延长处理时间（16-24小时）后，GREM1明显被细胞内吞，形成点状、核周分布模式。共聚焦显微镜Z轴扫描证实GREM1位于细胞内部而非膜表面。流式细胞术进一步显示，温度切换实验（4°C至37°C）后细胞表面 streptavidin 信号减少，表明GREM1发生了内化。

GREM1 uptake involves accumulation at the plasma membrane

时间进程实验显示，GREM1-FITC在5-15分钟内开始结合细胞膜，60分钟时形成环状膜结合模式，3-6小时后开始内化，16-24小时后主要位于细胞内。活细胞成像动态捕捉了这一过程，表明GREM1内吞并非即时发生，可能涉及与膜蛋白或受体的预先结合。

Heparin sulfate proteoglycans, but not glycosylation is required for GREM1 uptake into cells

肝素酶III处理去除细胞膜HSPGs后，GREM1内吞显著减少，表明HSPGs参与GREM1的结合和内化。而去糖基化处理（PNGase F）不影响GREM1内吞，说明GREM1的糖基化修饰对其摄取非必需。

GREM1 can be resecreted from cells after endocytosis and localizes to the early endosomes

内吞后的GREM1部分定位于早期内体（EEA1阳性区域），少量进入溶酶体（LAMP1阳性）和高尔基体，但未显著定位线粒体或内质网。有趣的是，将摄取GREM1-FITC的细胞条件培养基转移至新鲜细胞后，可检测到GREM1的再摄取，表明内化后的GREM1能被重新分泌并发挥功能。

GREM1-mCherry inhibits BMP2 signaling and is internalized by mammalian cells

为验证商业来源GREM1的可靠性，作者构建了GREM1-mCherry融合蛋白，证实其可分泌并抑制BMP2诱导的SMAD1/5/8磷酸化。条件培养基处理HeLa和HCT116细胞后，GREM1-mCherry被有效内化，其细胞内分布模式与GREM1-FITC一致。

GREM1 endocytosis is increased by BMP2 and not affected by acid washing

BMP2处理显著增强GREM1-mCherry的内吞（约5倍），酸洗脱实验排除了膜结合蛋白对荧光信号的干扰，证实BMP2促进的是GREM1的真正内化而非表面滞留。

A mutant GREM1 that cannot bind BMP2 displays reduced internalization

通过序列比对和AlphaFold3结构预测，作者构建了BMP结合缺陷型GREM1突变体（GREM1^Mut，F125A/I127A/F138A）。该突变体仍可正常分泌，但无法抑制BMP2信号传导。更重要的是，其内吞效率显著低于野生型GREM1，且BMP2处理无法增强其摄取。这表明GREM1的内吞严格依赖其与BMP的结合能力。

BMP2 increases GREM1^WT, but not GREM1^Mut-mCherry uptake into HCT116 cells

在HCT116细胞中，BMP2仅促进野生型GREM1的内吞，对突变型无影响，进一步确认BMP结合是GREM1胞吞的必要条件。

结论与讨论

本研究系统揭示了上皮细胞中一种新型的、BMP结合依赖性的GREM1内吞途径。该过程涉及网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞机制，需要细胞膜HSPGs的参与，内化后的GREM1定位于早期内体并可被重新分泌。尤为重要的是，BMP2不仅增强GREM1内吞，且GREM1与BMP的结合是其被细胞摄取的前提条件。

这一发现深化了对GREM1生物学功能的理解：除了作为经典的BMP细胞外拮抗剂，GREM1-BMP复合物的内吞可能通过降低细胞外BMP浓度，进一步增强其对BMP信号的抑制。在病理背景下（如结直肠癌），GREM1表达上调且被肿瘤细胞内化，可能通过破坏BMP/Wnt形态发生素梯度促进肿瘤进展。此外，本研究构建的BMP结合缺陷型GREM1突变体为后续研究GREM1非经典信号功能（如RTK激活）提供了重要工具。

该研究不仅揭示了GREM1的新型细胞生物学行为，也为针对GREM1-BMP互作的 therapeutic intervention 提供了新思路，尤其在GREM1高表达的肿瘤和纤维化疾病中，干预其内吞过程可能成为新的治疗策略。