S2Tag：一种用于捕获和固定 coiled-coil 蛋白的新型亲和标签及其在人类β-心脏肌球蛋白研究中的应用

本研究针对肌球蛋白体外实验中固定方式影响数据质量的问题，开发了一种新型S2Tag亲和标签系统。研究人员通过定位单克隆抗体10F12.3的表位，设计出可插入β-心脏肌球蛋白S2结构域的11氨基酸标签，成功实现了对野生型和S532P突变型肌球蛋白的特异性固定。该系统支持 ensemble 和 single-molecule 水平的运动性分析，并通过混合马达实验证实S532P突变虽降低滑动速度60%但维持正常力输出，为心肌病机制研究和 coiled-coil 蛋白固定提供了创新技术方案。

　　

在细胞的生命活动中，分子马达蛋白扮演着至关重要的角色，它们能够将化学能转化为机械能，驱动细胞运动、物质运输和肌肉收缩等过程。其中，肌球蛋白（myosin）作为最重要的分子马达家族之一，其功能异常与多种疾病密切相关，特别是心肌病（cardiomyopathy）。研究肌球蛋白的工作机制，不仅有助于理解生命活动的基本原理，也为相关疾病的诊断和治疗提供了重要线索。

然而，在研究肌球蛋白功能的体外实验中，一个长期存在的技术难题是如何将肌球蛋白稳定、特异且功能性地固定在实验表面。传统的非特异性吸附方法往往导致蛋白取向混乱、密度不均，严重影响实验数据的质量和可重复性。虽然抗体介导的固定方式有所改进，但缺乏通用性和特异性良好的标签系统，尤其对于具有 coiled-coil 结构的蛋白，如肌球蛋白的S2结构域，仍然缺乏有效的固定策略。

为了解决这一难题，研究人员开展了一项创新性研究，开发了一种名为S2Tag的新型亲和标签系统。该研究通过精细定位单克隆抗体10F12.3识别的表位，设计出11个氨基酸的短肽标签，可插入多种 coiled-coil 蛋白中，实现特异性固定。研究人员将这一系统应用于人类β-心脏肌球蛋白（β-cardiac myosin）的研究，包括一个导致扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy）的S532P突变体，为心脏病机制研究提供了新的技术平台。

该研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先通过免疫电子显微镜和片段截断分析精确 mapping 抗体表位；利用腺病毒载体系统在C2C12肌管细胞中表达带S2Tag的重组蛋白；通过抗体捕获 motility 实验分析肌球蛋白功能；采用三珠光学镊子（three-bead optical trap assay）进行单分子力学测量；并开发了混合马达 motility 实验（mixed-motor gliding assay）来研究不同肌球蛋白亚型间的机械相互作用。所有实验均使用经过纯化的重组蛋白，确保了数据的可靠性。

Epitope Mapping for 10F12.3 on Skeletal Muscle Myosin

研究人员首先确定了单克隆抗体10F12.3在骨骼肌肌球蛋白S2结构域中的精确表位。通过免疫电子显微镜技术，他们发现抗体结合位点距离头杆连接处44纳米，对应S2结构域起始后的312±28个氨基酸残基。进一步通过系列截断片段和点突变实验，最终将表位精确定位在一个11个氨基酸的序列“AEKHRADLSRE”上，并将其命名为S2Tag。结构建模显示这些关键残基在coiled-coil结构上具有良好的可及性。

Design and construction of S2Tag containing WT-cHMM

基于表位 mapping 结果，研究人员设计了包含S2Tag的人类β-心脏肌球蛋白重酶解肌球蛋白（β-cHMM）构建体。与原始设计（β-cHMM1.0）相比，新构建体（β-cHMM2.0）在S2结构域中插入了S2Tag序列，并在C末端添加了FLAG标签。实验结果表明，带有S2Tag的β-cHMM2.0能够通过10F12.3抗体有效固定在硝化纤维素包被的盖玻片上，并支持肌动蛋白丝（actin filaments）的平滑滑动。浓度依赖性实验显示，最佳 motility 速度在5-10 μg/mL浓度范围内达到，比非特异性结合所需的浓度低8-10倍。

S2Tag Immobilized WT-cHMM in Optical Trapping Assay

为了验证S2Tag在单分子研究中的实用性，研究人员进行了三珠光学镊子实验。通过10F12.3抗体将WT-cHMM2.0稀疏固定在 pedestal 珠上，观察其与悬浮肌动蛋白丝的相互作用。实验检测到清晰的位移事件，结合持续时间符合单指数分布，解离速率常数（k_detach）为5.9 s^-1，表明ATP结合是解离的限速步骤。ensemble 平均分析揭示了β-心脏肌球蛋白特征性的两步动力冲程（power stroke），第一步与磷酸盐释放相关（4.03 nm），第二步与ADP释放相关（1.10 nm），与先前报道的WT-cHMM数值一致。

Mechanical interactions between WT-cHMM and S532P-cHMM mutant cardiac myosin

研究人员利用S2Tag系统研究了WT和S532P突变型β-心脏肌球蛋白之间的机械相互作用。通过混合马达 motility 实验，他们将不同比例的WT和S532P β-cHMM2.0固定在同一个表面上，测量肌动蛋白丝的滑动速度。实验结果显示，WT和S532P混合时，速度与WT比例呈线性关系，表明两种肌球蛋白产生的力相当。然而，当心脏肌球蛋白与快得多的骨骼肌肌球蛋白（Sk-myosin）混合时，速度变化呈现上凹曲线，表明心脏肌球蛋白产生的力比骨骼肌肌球蛋白强约3倍。通过Harris和Warshaw的机械相互作用模型拟合，计算出S532P与WT的力比（F_os/F_of）为1.0±0.3，而两种心脏肌球蛋白与骨骼肌肌球蛋白的力比均为3.3±0.8，证实S532P突变虽然使滑动速度降低了60%，但力产生能力与WT相当。

Comparison to other approaches

研究人员将S2Tag系统与其他固定策略进行了比较。目前常用的C-tag/PDZ clamp系统虽然适用于肌球蛋白S1片段和单头肌球蛋白，但对于需要研究自动抑制状态（如 interacting head motif, IHM）的双头肌球蛋白分子（如β-cHMM）则存在局限性。S2Tag的优势在于其位于天然的S2结构域中，支持IHM形成，对应肌肉收缩时从粗丝释放的S2结构域，并在单分子实验中使运动结构域位于 assay 表面上方50-60纳米处，减少了表面干扰。

研究结论表明，S2Tag是一种高效、特异的新型亲和标签系统，可用于 coiled-coil 蛋白的固定和功能研究。通过该系统，研究人员成功实现了对野生型和S532P突变型β-心脏肌球蛋白的特异性固定和功能分析，发现该突变虽然显著降低滑动速度，但维持了正常的力产生能力。这一发现对于理解扩张型心肌病的发病机制具有重要意义，因为功率输出是力和速度的乘积，速度的降低会直接影响心脏的整体性能。

该研究的创新之处在于开发了一种通用的 coiled-coil 蛋白固定策略，为分子马达蛋白的功能研究提供了新的技术平台。S2Tag系统不仅适用于肌球蛋白研究，还可扩展到其他具有 coiled-coil 结构的蛋白，为生命科学和医学研究提供了有价值的工具。论文发表在《Journal of Biomechanics》上，为生物力学和分子马达研究领域做出了重要贡献。

这项研究的成功开展，得益于多学科团队的紧密合作，包括分子生物学、生物化学、生物物理学和生物工程等多个领域的专家。通过跨学科的技术整合和创新，研究人员克服了长期存在的技术难题，为相关领域的研究提供了新的思路和方法。