《Journal of Chromatography A》：Multi-attribute characterization of pharmaceutical materials by HPLC coupled with Charged Aerosol Detection
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高效液相色谱-电雾式检测器（HPLC-CAD）新方法开发，可在26分钟内同步测定2S-FHPM的活性成分、手性/非手性杂质及反离子含量，经ICH Q2(R2)规范验证显示线性、灵敏度、精密度等指标优异，首次实现无需衍生化处理的单方法全面表征，适用于加速药物研发中的质量分析需求。
弗兰克·赫罗瓦特（Frank Hrovat）| 玛拉·齐默（Mara Zimmer）| 梅洛迪·傅（Melody Fu）| 杰森·格伦哈根（Jason Gruenhagen）| 凯莉·张（Kelly Zhang）| 胡安·边（Juan Bian）| 杰西卡·林（Jessica Lin）
合成分子制药科学，基因泰克公司（Synthetic Molecule Pharmaceutical Science, Genentech, Inc.），地址：1 DNA Way, 南旧金山，加利福尼亚州，94080，美国
摘要
((2R,7aS)-2-氟四氢-1H-吡咯林-7a(5H)-基)甲醇（2S-FHPM）是药物分子中的常见构建块，但其体积小且缺乏发色团，给分析带来了显著挑战。为了解决这个问题，我们开发了一种高效液相色谱-带电气溶胶检测器（HPLC-CAD）方法，能够在26分钟内同时测定2S-FHPM的含量、手性和非手性杂质以及反离子的含量。该方法表现出优异的特异性、灵敏度（0.1%）、线性（R2 > 0.99）和精度（保留时间和峰面积的相对标准偏差均低于2%）。此外，通过定量核磁共振（qNMR）对含量进行验证，通过高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）结合衍生化技术对手性杂质进行验证，通过离子色谱（IC）对反离子含量进行验证。这是首次使用单一非衍生化HPLC方法对2S-FHPM进行全面表征的研究，使其非常适合在快速的药物开发阶段进行高效表征和质量控制。
引言
药物开发过程通常漫长且复杂，典型的从药物研发到上市周期长达15年[1]。这一时间线突显了加快化学制造控制（CMC）发展的重要性，以便尽快获得可用于临床评估的高质量候选药物。近年来，高通量筛选技术结合机器学习和人工智能的应用，提高了针对单一药物靶点的潜在候选药物数量[2,3]。因此，分析化学实验室常常需要同时支持多个候选药物的研发。为了有效管理这种不断增加的工作量并加快研发进度，需要可靠的分析方法来表征原材料、起始材料、中间体和最终药物的各种质量属性。这些属性包括效力（药物中的有效成分含量）、杂质谱（药物中的不需要的有机成分）、残留溶剂水平（药物中的有机溶剂残留量）以及反离子含量（如果药物以盐的形式存在，则为盐的含量）。一种能够同时测定多个关键属性的通用方法具有显著优势，可以提高分析化学实验室的效率并优化资源利用，从而直接促进药物开发周期的加快[1,4]。
大多数小分子药物（59%）至少含有一个氮杂环[5]。吡咯利嗪类化合物是小分子合成中常用的构建块之一，具有潜在的抗癌、抗菌和抗病毒活性[6]。
((2R,7aS)-2-氟四氢-1H-吡咯林-7a(5H)-基)甲醇（2S-FHPM）就是这类化合物中的一种，广泛用于药物合成。这类化合物不含紫外发色团，因此需要采用不同于标准HPLC-UV的检测方法。
在2S-FHPM的含量、手性/非手性杂质和盐含量的分析中，研究人员采用了多种技术组合。由于该化合物的分子量为159.20 g/mol，具有挥发性，一些研究者选择了气相色谱（GC）进行检测。然而，样品中大量的盐酸盐或富马酸盐会对GC分析产生不利影响[7]。虽然顶空进样可以缓解盐的影响，但无法解决胺官能与GC柱之间的相互作用问题，除非进行衍生化处理，否则会导致峰形拖尾[8]。HPLC-UV也曾用于吡咯利嗪类生物碱的分析[9]，但衍生化过程会产生干扰杂质分析的假峰，影响方法的特异性。此外，衍生化过程本身劳动强度大且耗时较长。HPLC-MS/MS也曾用于食品中吡咯利嗪类的分析[10,11]，但MS定量方法存在变异性和操作复杂性的局限。
与带电气溶胶检测器（CAD）结合使用的HPLC对于2S-FHPM这类化合物具有显著优势，因为它可以在不进行衍生化的情况下直接进行分析，大大加快了方法开发和常规样品分析的速度。此外，CAD适用于多种分析物，包括半挥发性化合物和反离子[11]，从而实现了含量、反离子含量以及手性/非手性杂质等多重关键属性的同时测定。通过将多种分析整合到一台HPLC-CAD仪器中，我们可以简化实验室操作，释放其他分析设备（如GC、IC、HPLC-UV）的资源，从而提高整体实验室效率，支持药物开发的加速。
在本研究中，我们开发了一种简单高效的HPLC-CAD方法，能够在26分钟内同时测定2S-FHPM的含量、反离子含量以及手性/非手性杂质。优化了HPLC的参数（如温度、梯度曲线和流速）以实现良好的分离效果，并调整了CAD的参数（如蒸发温度、功率函数值和过滤器设置）以最大化定量性能。该方法完全符合ICH Q2(R2)指南的要求，表现出优异的线性、灵敏度、精度和准确性。据我们所知，这是首次报道的2S-FHPM的多属性同时分析方法。此外，该开发方法有望应用于同类其他化合物，为加速药物开发提供有价值的分析工具。
章节摘录
化学物质和试剂
((2R,7aS)-2-氟四氢-1H-吡咯林-7a(5H)-基)甲醇（2S-FHPM）及其非对映异构体标记物((2R,7aR)-2-氟四氢-1H-吡咯林-7a(5H)-基)甲醇（2R-FHPM）富马酸盐均购自Pharmablock（中国江苏省南京市）。富马酸、0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液、冰醋酸和三乙胺（TEA）、甲酸、醋酸和乙腈均购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。0.1%三氟乙酸溶液……
HPLC方法开发
由于2S-FHPM的极性适中，评估了几种具有极性保留特性的色谱柱，包括Agilent Poroshell 120 Sb-Aq（2.7 μm, 3×150 mm）、Agilent SB-Phenyl（3.5 μm, 4.6×150 mm）、Phenomenex Luna CN（3.5 μm, 4.6×150 mm）、Mac Mod ACE Excel 3 C18-PFP（3 μm, 3×150 mm）和Waters Atlantis T3（5 μm, 4.6×250 mm）（见补充图1）。根据不同色谱柱的尺寸调整了梯度曲线和流速。Waters T3色谱柱提供了最佳的保留效果、分辨率和峰形。
结论
我们开发了一种新型的HPLC-CAD方法，用于((2R,8S)-2-氟-1,2,3,5,6,7-六氢吡咯林-8-基)甲醇（2S-FHPM）的分析。该方法能够在26分钟内同时测定其含量、手性/非手性杂质和反离子的含量。该方法经过ICH Q2(R2)指南验证，表现出优异的线性、灵敏度、精度和准确性。通过优化色谱和CAD检测器参数，实现了对这类无发色团小分子的有效表征。
CRediT作者贡献声明
弗兰克·赫罗瓦特（Frank Hrovat）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、实验设计、数据分析。玛拉·齐默（Mara Zimmer）：数据分析。梅洛迪·傅（Melody Fu）：数据分析。杰森·格伦哈根（Jason Gruenhagen）：监督、资源协调。凯莉·张（Kelly Zhang）：撰写 – 审稿与编辑、监督、实验设计、概念构思。胡安·边（Juan Bian）：撰写 – 审稿与编辑、监督、实验设计、概念构思。杰西卡·林（Jessica Lin）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、实验设计、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
