利用AFMFit通过快速非线性NMA和FFT搜索解析原子力显微镜数据中的构象动力学

本研究针对原子力显微镜（AFM）在解析蛋白质动态构象中的技术瓶颈，开发了AFMfit这一开源计算工具。该方法基于非线性正态模式分析（NMA）和快速傅里叶变换（FFT）搜索算法，实现了对数百张AFM图像的快速柔性拟合，成功重构了活化因子V（FVA）和膜嵌合瞬时受体电位通道TRPV3的构象集合，为单分子水平研究生物大分子的动态过程提供了突破性技术方案。

　　

在生命科学领域，观测生物分子在天然环境中的动态过程是理解其生物学功能的关键。虽然小角散射或溶液核磁共振等技术能在原子尺度提供信息，但原子力显微镜（AFM）以其在近生理条件下达到纳米级分辨率的能力，成为研究单分子构象动态的独特技术。然而，AFM实验测得的二维分子表面与单分子三维构象动态之间的转换存在巨大挑战——分辨率受探针尺寸限制、分子取向偏好性导致的重建各向异性，以及柔性生物分子连续运动表征困难等问题，严重制约了该技术的应用潜力。

针对这些难题，法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学的Rémi Vuillemot团队在《Communications Biology》发表了突破性研究成果。他们开发了AFMfit这一创新型柔性拟合流程，通过将输入原子模型与多个AFM观测数据进行匹配，构建能够明确描述AFM实验的构象集合。该方法采用基于非线性正态模式分析（NMA）方法NOLB的新型快速拟合算法，可在单工作站上数分钟内处理数百张单分子AFM图像，甚至能够分析包含高速AFM（HS-AFM）的大规模数据集。

研究团队主要运用了四大技术方法：一是基于碰撞检测原理的伪AFM图像生成算法，通过高斯函数平滑近似探针形状；二是采用快速傅里叶变换（FFT）加速的全局刚性拟合技术，通过球形斐波那契格点采样实现高效三维旋转搜索；三是基于全原子弹性网络模型（ENM）的非线性正态模式分析（NOLB），使用8埃截断距离计算低频正常模式；四是结合像素级均方根偏差（pixel-RMSD）和结构均方根偏差（structure-RMSD）的双重优化目标函数，通过正则化参数λ平衡数据拟合与模型变形约束。

合成EF2数据的验证评估

研究人员首先使用延伸因子2（EF2，PDB代码1N0V）的蛋白质模型创建合成AFM数据来验证方法性能。通过非线性NMA方法NOLB施加柔性变形生成100个构象的集合，采用第7和第8两个最低频率正常模式（模式1-6对应刚体运动未使用）产生4埃RMSD变形幅度的圆形构象空间分布。结果显示，AFMfit能够从噪声合成AFM数据中准确恢复真实构象集合。在选定AFM图像的拟合示例中，刚性拟合单独处理时模型与图像存在错配（角度误差近180°），而柔性拟合成功纠正了错配，将角度误差降至3°。通过主成分分析（PCA）显示，拟合构象集合与真实集合在变形幅度和分布上高度一致，像素RMSD平均降低超过1埃，结构RMSD从平均3.9埃降至1.1埃，角度误差从平均11.1°降至3.1°以下。

FVA实验数据的分析应用

在研究第二阶段，团队将拟合流程应用于活化凝血因子V（FVA）的实验AFM数据。FVA是参与凝血级联反应的异源二聚体蛋白，由重链（A1-A2结构域）和轻链（A3-C1-C2结构域）组成。研究使用最近通过冷冻电镜获得的完整人FVA结构模型（PDB代码7TPP）作为初始状态，通过NMA选择六个零频率和八个最低频率非零正常模式（主要对应C结构域运动），将数据集中的颗粒数从20个增加至54个。

AFMfit成功恢复了FVA的C结构域动力学。拟合程序显著提高了初始模型与AFM数据的相似性，刚性和柔性拟合间的像素RMSD平均降低0.4埃。典型案例如图3a所示，FVA的C2结构域发生旋转（见图3a箭头），使像素RMSD降低0.52埃，产生幅度为4.9埃结构RMSD的柔性运动。对54个拟合模型进行PCA分析获得的构象空间显示，前两个主成分解释了总方差的65%（PC1为49%，PC2为17%）。PC1相关的构象变化表现为C结构域沿A三聚体形成的伪对称轴线性位移，同时伴随C1和C2的旋转使两结构域间夹角张开；PC2则表现为C结构域在A三聚体平面内的旋转。这些发现与2014年研究中报道的C1-C2夹角变化高度一致。

TRPV3通道的HS-AFM数据分析

团队进一步将方法应用于瞬态受体电位通道TRPV3的高速AFM（HS-AFM）数据。TRPV3是四聚体或五聚体膜蛋白，研究人员分析了两段HS-AFM电影：第一段包含27帧中提取的177个单分子，存在组成异质性（不同寡聚状态）；第二段以更高分辨率捕获两个单分子（一个五聚体状态，一个四聚体状态）。AFMfit通过初步分类处理了组成异质性，使用TRPV3五聚体（PDB代码6DVW）和四聚体（AlphaFold2预测模型）作为模板进行分类。

对第二段电影拟合模型进行PCA分析显示，第一主成分分离了两种寡聚状态，第二主成分主要与四聚体的柔性运动相关（平面内扁平化运动），第三主成分主要与五聚体的柔性运动相关（不对称平面内运动）。这些柔性运动具有相似振幅（四聚体和五聚体极值间RMSD均为6.3埃），且围绕对应输入模型的平衡状态分布。针对第二段电影中的四聚体TRPV3进行的单独PCA分析显示，沿主柔性成分（PC1）的位移对应x轴方向的平面扁平化，负位移对应y轴方向的相同运动。PC1的时间演化以零为中心且帧间无相关性，这与HS-AFM采样速率（每300毫秒1帧）远慢于观察到的平衡动力学相符。

部分无序蛋白质的合成验证

团队还通过AlphaFold预测的包含柔性无序C末端区域（残基1337-1368）的蛋白质模型（AF-Q9ULK4）进行了合成实验，测试AFMfit处理柔性区域信号缺失的能力。实验使用裁剪C末端区域的结构蛋白模型生成合成AFM图像，然后尝试将完整的未裁剪结构拟合到该图像。结果显示，结合柔性显著减少了与刚性拟合相比的对齐误差（刚性拟合角度误差25° versus 结合刚性和柔性步骤的13°），证明了该方法处理局部变形的能力。

研究结论表明，AFMfit是首个将基于NMA的拟合应用于AFM图像分析的方法，能够从合成数据中恢复给定构象空间，并在实验性AFM/HS-AFM数据集上验证了与既往研究结果的吻合性。EF2和FVA实验证实了该方法处理AFM图像中大尺度功能变化（4-9埃运动）的能力，TRPV3实验则展示了处理组成异质性（混合寡聚状态）和解析小尺度波动的能力。方法的速度优势使其能够在个人桌面上数分钟内处理数百至数千张AFM图像，为研究生物分子构象动力学提供了强大工具。

讨论部分指出，使用NMA近似输入模型的低维运动流形存在一定局限性：线性正常模式在高变形幅度下原子间距不再保持，分子结构部分可能失真；弹性网络模型（ENM）可能将正常模式精度限制在最低频率。但通过非线性NMA方法NOLB解决了失真问题，且选择少量低频正常模式适合AFM图像分辨率有限的特点。研究人员建议使用少于十个最低频率正常模式，并通过HOPMA等方法修剪弹性连接以改进初始模型的功能动力学。

研究还探讨了对称蛋白质分析中存在的多重拟合姿态问题，以及HS-AFM中探针形状畸变的潜在影响。虽然AFMfit未显式校正此类伪影，但对大构象集合的分析有助于减轻其影响，因为跨多帧和分子的可重复运动不太可能仅由扫描畸变引起。未来方法学发展可包括在拟合协议中加入基于扫描方向的惩罚项。

总之，这项研究开发的AFMfit方法突破了AFM数据解释的技术瓶颈，通过创新性的计算算法实现了对生物大分子构象动态的高效、精准解析，为单分子水平研究蛋白质动力学提供了强大工具，具有重要的科学意义和应用前景。