异亮氨酰-tRNA合成酶（IleRS）耗竭揭示脓肿分枝杆菌与海分枝杆菌的代谢脆弱性及治疗新靶点

本研究针对非结核分枝杆菌（NTM）耐药性强、宿主环境适应能力高等临床难题，聚焦异亮氨酰-tRNA合成酶（IleRS）在病原体代谢调控中的核心作用。通过CRISPRi基因沉默技术结合多组学分析，发现IleRS缺失会破坏支链氨基酸和泛酸生物合成通路，导致代谢脆弱性并增强吡嗪酰胺（PZA）敏感性。该研究为克服NTM耐药性提供了新靶点，并为联合用药策略奠定了理论基础。

　　

在微生物感染领域，非结核分枝杆菌（NTM）正成为日益严重的公共卫生威胁。其中，脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）和海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）尤为棘手——它们不仅对多种抗生素表现出先天耐药性，还能在宿主恶劣环境中持续存活，导致囊性纤维化患者和免疫缺陷人群面临治疗失败的风险。传统结核病治疗方案对这些非结核分枝杆菌往往收效甚微，迫切需要开发针对新靶点的治疗策略。

氨基酸-tRNA合成酶（aaRSs）作为蛋白质合成的核心元件，近年来备受抗菌药物研发关注。其中异亮氨酰-tRNA合成酶（IleRS）因其在催化异亮氨酸与tRNA结合过程中的不可替代性，成为潜在靶点。然而，由于分枝杆菌IleRS具有真核生物样特征，对已知抑制剂穆匹罗星（mupirocin）天然耐药，且其在病原体代谢网络中的全局调控作用尚未明确，制约了靶向治疗的开发。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，上海交通大学农业与生物学院王哲团队联合多家科研机构，通过多维技术手段揭示了IleRS在分枝杆菌生长、代谢和致病过程中的关键作用，并发现其与现有抗结核药物吡嗪酰胺（PZA）的协同效应，为临床联合治疗提供了新思路。

研究主要采用CRISPR干扰（CRISPRi）技术构建条件性基因沉默菌株，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行代谢组学分析，利用RNA测序技术解析巨噬细胞转录组响应，并结合小鼠感染模型（包括脓肿分枝杆菌鼻腔感染模型和海分枝杆菌足垫感染模型）进行体内验证。

IleRS耗竭损害脓肿分枝杆菌和海分枝杆菌的生长与持久存活

研究人员发现IleRS是分枝杆菌存活不可或缺的酶，无法获得敲除菌株。通过CRISPRi技术成功构建了IleRS条件性沉默菌株（IleRS_KD），证明IleRS耗竭显著抑制了两种分枝杆菌在固体培养基和液体培养基中的生长。在模拟宿主环境的营养限制条件下（以谷氨酰胺、铵离子或天冬氨酸作为唯一氮源），IleRS沉默菌株完全无法生长。值得注意的是，当胆固醇作为唯一碳源时，脓肿分枝杆菌IleRS_KD菌株未显示明显生长缺陷，而海分枝杆菌突变株则无法生长，表明物种间代谢灵活性存在差异。

在模拟休眠状态的多重应激模型中，IleRS耗竭使脓肿分枝杆菌和海分枝杆菌的存活率分别降低了约2个和3个对数单位。巨噬细胞感染实验进一步证实，IleRS沉默显著削弱了细菌在RAW264.7和THP-1巨噬细胞内的复制能力，其中海分枝杆菌突变株的载量比对照菌株低2-3个对数单位。

代谢谱分析揭示IleRS耗竭的特异性特征

通过LC-MS代谢组学分析发现，IleRS沉默导致异亮氨酸生物合成通路中5种关键中间产物积累，引起氨基酸池广泛升高。支链氨基酸（BCAA）生物合成通路显著上调，其中2-酮异戊酸（KIV）增加了12.9倍。KIV作为缬氨酸向泛酸转化通路的前体，其积累导致泛酸生物合成通流量改变。尽管脓肿分枝杆菌试图通过增强天冬氨酸向泛酸的转化来补偿，但整体上仍导致辅酶A合成受阻，进而影响能量生产和脂质生物合成。

靶向IleRS增强分枝杆菌对PZA的敏感性

基于代谢发现，研究人员测试了IleRS耗竭对吡嗪酰胺（PZA）敏感性的影响。在酸性条件下，IleRS沉默与PZA联用表现出明显的协同杀菌效应，且具有ATC剂量依赖性。在非复制条件下，IleRS耗竭显著缩短了PZA杀菌效应的起始时间。这种增敏效应特异性针对PZA，对其他常用抗分枝杆菌药物（如异烟肼、利福平、贝达喹啉等）无影响。

IleRS在小鼠感染模型中至关重要

小鼠感染模型证实了IleRS在体内感染中的关键作用。脓肿分枝杆菌肺部感染模型中，IleRS_KD菌株引起的肺部病理更轻，血液中细菌载量比对照组低1个对数单位以上。海分枝杆菌足垫感染模型中，对照菌株引起严重足部肿胀和溃疡，而IleRS_KD菌株仅引起轻度肿胀，疾病进展显著受限，足垫载量降低至少2个对数单位。

巨噬细胞对IleRS耗竭菌株的感染响应

转录组分析显示，感染IleRS_KD菌株的巨噬细胞中胆固醇外排转运蛋白Abca1表达上调，与胆固醇代谢激活一致。基因集富集分析（GSEA）表明，IleRS沉默促进了溶酶体组织过程，但抑制了先天免疫感应（特别是胞质DNA感应通路）以及核心转录和细胞周期机制。促炎细胞因子（Il6、Tnf、Ifng、Il1b）表达降低，表明炎症反应减弱。

讨论与结论

本研究通过整合条件性基因沉默、微生物学、代谢组学和转录组学分析，系统阐述了IleRS在分枝杆菌生长、持续感染和毒力中的关键作用。研究发现IleRS缺陷引发的代谢脆弱性不仅源于单一酶活性丧失，还涉及多种代谢紊乱：未充电tRNA积累导致细胞氨基酸饥饿；支链氨基酸中间产物毒性积累；泛酸生物合成中间产物积累导致辅酶A生产抑制；以及与核苷酸生物合成、戊糖磷酸途径和糖酵解相关的代谢通量显著下调。

重要的是，IleRS耗显著增强了分枝杆菌对PZA的敏感性，尤其是在巨噬细胞感染和休眠条件下。尽管PZA本身对NTM的临床疗效有限，但针对泛酸/辅酶A生物合成通路的代谢佐剂与aaRS抑制联用，为克服顽固性NTM感染的固有耐药性提供了合理策略。

宿主-病原体相互作用研究显示，IleRS缺陷导致巨噬细胞中Abcg1和Abca1表达上调，可能通过抗炎作用减轻免疫介导的组织损伤，并促进分枝杆菌感染的清除。研究证实IleRS是抗分枝杆菌治疗的潜在靶点，虽然分枝杆菌IleRS与真核细胞质的同源物高度相似，对穆匹罗星天然耐药，但通过别构或构象选择性抑制剂的开发，仍可能实现特异性靶向。

该研究不仅揭示了IleRS与BCAA、泛酸代谢、炎症和宿主脂质代谢之间此前未被认识的关联，还为减少非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌耐药性、提高现有治疗方案疗效提供了新视角。