跨物种禽类胚胎干细胞系的成功建立及其在种系嵌合与生物多样性保护中的突破性应用

本研究针对禽类缺乏真正种系兼容胚胎干细胞(ES细胞)的技术瓶颈，通过优化培养条件成功建立了鸡及其他七种禽类的ES细胞系。研究人员发现卵转铁蛋白(ovotransferrin)结合Wnt/β-catenin和PKC信号通路抑制剂的OT/2i培养体系可稳定维持鸡ES细胞多能性，进一步通过添加SB431542和鸡白血病抑制因子(chLIF)拓展到其他禽类。研究证实这些ES细胞可高效形成体细胞与种系嵌合体，并能在体外和体内分化为原始生殖细胞(PGCs)。该突破为禽类基因编辑、生物多样性保护及生物技术应用提供了全新平台。论文发表于《Nature Biotechnology》。

　　

禽类尤其是鸡，作为发育生物学、病毒学、免疫学和表观遗传学等领域的重要模式生物，长期以来因缺乏有效的遗传操作工具而限制了其应用潜力。尽管小鼠和大鼠的种系兼容胚胎干细胞(ES细胞)已被成功建立，但禽类ES细胞的衍生一直面临重大挑战。传统观点认为禽类种系规范可能通过母系遗传预先决定，无法从外胚层细胞或衍生ES细胞中诱导产生。虽然禽类原始生殖细胞(PGCs)的研究取得了一定进展，但其培养体系主要局限于鸡，且无法分化为体细胞 lineages。这种技术瓶颈严重制约了禽类遗传学研究和生物技术应用。

为突破这一困境，Xi Chen等研究人员在《Nature Biotechnology》发表了题为"Derivation of embryonic stem cells across avian species"的重要研究成果。他们通过系统性筛选小分子、生长因子和细胞因子组合，成功建立了鸡及其他七种禽类的ES细胞培养体系，并深入证明了这些细胞的多能性和种系传递能力。

研究采用了多种关键技术方法：通过分子量分级和硫酸铵沉淀从卵黄中鉴定关键成分；使用RNA测序(RNA-seq)进行转录组分析；采用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑；通过体外胚胎体(EB)分化实验评估多向分化潜能；利用ex ovo和in ovo嵌合体实验验证发育潜能；采用免疫荧光染色和原位杂交技术检测细胞标志物表达。研究样本包括鸡、鹌鹑、鹅、鸭、火鸡、雉鸡、孔雀和鸵鸟等多种禽类的受精卵。

优化鸡ES细胞培养条件

研究人员从新鲜产下的罗德岛红鸡(RIR)鸡蛋中分离EGK.X期胚盘细胞，通过筛选发现Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1和PKC抑制剂Go6983能促进未分化ES细胞集落形成。有趣的是，他们观察到携带较多卵黄的胚胎分离效果更好，最终鉴定出卵转铁蛋白(ovotransferrin)是卵黄中维持自我更新的关键成分。结合ovotransferrin、IWR-1和Go6983的OT/2i培养体系能稳定维持鸡ES细胞长期传代培养。

跨物种禽类ES细胞培养体系

将OT/2i体系应用于雉鸡、鸭和火鸡时，研究人员发现ES细胞集落会出现自发分化为搏动的心肌细胞。通过添加activin受体激酶抑制剂SB431542，成功防止了这种分化并维持了这些禽类ES细胞的未分化状态。对于鹌鹑ES细胞，还需要添加鸡白血病抑制因子(chLIF)才能维持长期自我更新，而鸵鸟ES细胞则在chLIF存在时会发生分化，表明不同禽类对LIF信号存在物种特异性反应。

OT/3i/chLIF培养的鸡ES细胞具有多能性

通过胚胎体形成实验证实鸡ES细胞能分化为三个胚层的细胞类型：TUJ1阳性细胞(外胚层)、MHC阳性细胞(中胚层)和GATA4阳性细胞(内胚层)。转录组分析显示鸡ES细胞与EGK.X期细胞高度相似，但明显不同于HH4期原肠胚细胞。基因表达谱分析发现多能性核心基因Nanog、Pou5f3和Klf4在ES细胞和EGK.X期胚胎中高表达，而分化相关基因显著下调。

鸡ES细胞适用于精确基因组编辑

利用GFP向BFP转换实验，研究人员证实鸡ES细胞能进行高效的CRISPR-Cas9介导的基因组编辑。通过电转Cas9蛋白、GFP单向导RNA和单链寡核苷酸(ssODN)供体，实现了9.3%的GFP-to-BFP敲入转换效率，表明鸡ES细胞可作为强大的基因编辑平台。

禽类ES细胞表达核心多能性因子

鹌鹑、鹅和鸵鸟ES细胞都表达高水平的多能性相关转录因子，包括Nanog或Nanog样蛋白、Lin28a/b和Pou5f3。与哺乳动物ES细胞不同，禽类ES细胞不表达Sox2，而是表达Sox3，Klf家族基因主要表达Klf3、Klf5和Klf6，而非哺乳动物中高表达的Klf4。

鸡ES细胞具有嵌合能力

将GFP标记的鸡ES细胞移植到ex ovo培养的鸡胚胎中，能高效整合并形成嵌合胚胎。通过in ovo嵌合实验，发现亚致死剂量 irradiation(500-550 cGy)能显著提高嵌合率。长期培养的鸡ES细胞(60代饲养层培养加15代无饲养层培养)仍保持嵌合能力。重要的是，鸡ES细胞能贡献于体细胞和胚外细胞系，这一特性与小鼠ES细胞不同。

禽类ES细胞贡献种内和种间嵌合体

研究人员成功将鹌鹑和鹅ES细胞移植到鸡胚胎中形成种间嵌合体，证明这些细胞能参与受体鸡胚胎的体节发生过程。通过羽毛颜色嵌合现象证实了鹌鹑ES细胞在鸡胚胎中的稳定整合。此外，鹌鹑ES细胞移植到鹌鹑胚胎中也能形成高效的种内嵌合体，贡献于多个胚层来源的器官。

禽类ES细胞能分化为生殖细胞

通过胚胎体分化实验，研究人员发现鸡ES细胞能表达生殖细胞标志物Dazl、Cvh、Cxcr4、Sycp3和Stra8。免疫荧光染色证实第3-4天的胚胎体中有1-3%的细胞表达DAZL蛋白。通过克隆扩增实验，证明培养的鹅ES细胞具有产生DAZL阳性细胞的能力。在移植实验中，鸡ES细胞来源的生殖细胞能在嵌合体性腺中形成细胞簇，表达DAZL和SSEA-1等生殖细胞标志物。

本研究首次成功建立了多种禽类的真正种系兼容ES细胞系，解决了禽类遗传学研究中长期存在的技术瓶颈。研究人员开发的OT/3i/chLIF培养体系不仅能稳定维持鸡ES细胞的多能性，还能成功应用于其他七种禽类，包括雉鸡、鸭、火鸡、鹌鹑、鹅、孔雀和鸵鸟。这些ES细胞表现出与EGK.X期外胚层细胞相似的转录组特征，能高效形成体细胞和种系嵌合体，并能在体外和体内分化为生殖细胞系。

研究结果挑战了禽类种系通过母系遗传预先决定的传统观点，证明ES细胞能产生功能性生殖细胞。不同禽类对LIF信号通路的差异性反应揭示了物种特异性调控机制的重要性。虽然研究未能获得来自高等嵌合体的后代，但这主要归因于品系间相容性问题，而非ES细胞本身的能力限制。

该突破为禽类遗传修饰、濒危物种保护、生物反应器开发和禽类生物技术应用提供了强大平台。结合基因编辑技术，禽类ES细胞将成为发育生物学、生殖生物学和比较基因组学研究的重要工具。此外，研究建立的培养条件和方法学也为其他物种多能干细胞的衍生提供了重要参考，推动了多能性生物学和进化发育生物学的发展。