相分离NDF-FACT凝聚体通过促进染色质转录延伸维持干细胞基因组稳定性

本研究针对FACT复合体如何协助RNA聚合酶II克服染色质屏障的机制难题，通过发现NDF介导的相分离形成FACT凝聚体这一关键机制，揭示了其通过创建特殊生化环境将转录效率提升约20倍，并在人类干细胞中证明该凝聚体对维持转录稳态和染色质完整性的重要作用，为理解真核生物转录调控提供了新范式。

　　

在真核生物细胞中，基因表达受到精密调控，而核小体作为染色质的基本单位，却构成了转录过程中的天然屏障。它们不仅阻止序列特异性转录因子接近调控区域，还阻碍RNA聚合酶II（Pol II）在基因转录过程中的延伸，从而在多个层面上控制基因表达。为了克服这些染色质障碍，细胞进化出了多种辅助因子来协助Pol II进行转录，其中人类核小体去稳定因子（NDF，又称Glyr1、N-PAC或NP60）和染色质转录促进因子（FACT）复合体就是两个关键蛋白。

然而令人困惑的是，尽管研究表明纯化的FACT与Pol II、DNA或完整核小体的直接相互作用十分有限，但它却能在细胞内有效发挥作用。最近的结构研究显示，FACT通过与部分解组装核小体上通常被DNA遮蔽的H2A/H2B二聚体区域结合，为理解组蛋白在核小体解组装过程中的保留提供了线索。但关于FACT如何被招募到染色质上、如何促进核小体屏障的通过以及其大量的内在无序区域（IDRs，约占复合体的50%）如何参与功能等问题仍然悬而未解。

在这项发表于《Nature Cell Biology》的研究中，研究人员发现NDF介导的相分离是FACT发挥细胞功能的关键机制。相分离使得蛋白质能够形成动态的无膜隔室，从而组织特殊的生化反应。研究发现NDF-FACT凝聚体在转录的Pol II上形成，沿着染色质移动，并增强核小体解组装和Pol II进程。在人类干细胞中，破坏这些凝聚体会显著降低FACT在染色质上的占据，导致类似于FACT耗竭的缺陷。这些发现揭示了相分离对FACT功能和基因调控的重要性。

研究团队主要运用了以下几类关键技术方法：一是通过蛋白质纯化和体外生化实验分析蛋白质相互作用和功能；二是利用单分子光学镊子和荧光成像技术实时观察转录动态和凝聚体形成过程；三是采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建内源标记的干细胞系；四是运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、Cut&Run、PRO-seq、TT-seq和MNase-seq等高通量测序技术进行全基因组水平的功能分析。

NDF和FACT协同增强Pol II转录

研究人员通过稳定表达GFP和Flag标签人NDF的HeLa细胞进行串联亲和纯化结合质谱分析，发现FACT复合体是NDF的主要关联伙伴。体外实验证实了NDF与FACT的直接相互作用，且这种相互作用主要由Spt16亚基介导。体外转录延伸实验表明，NDF和FACT能够协同促进Pol II转录通过核小体，两者共同作用时消除了SHL-1之前的所有暂停，显著增加了全长转录产物。酶动力学分析显示，与单独使用FACT相比，NDF和FACT共同使Pol II的转录速率提高了三倍，米氏常数降低了四倍。

NDF和FACT形成相分离凝聚体

由于NDF和FACT都含有大量的内在无序区域（IDRs），研究人员假设它们可能形成多价相互作用导致相分离凝聚体。实验发现，虽然纯化的NDF-GFP或FACT-mCherry单独不能形成凝聚体，但在生理盐条件下混合后立即产生微米级的球形液滴。相分离在各种缓冲液中均可发生，但高离子强度和去污剂条件除外。添加Pol II延伸复合物甚至在更低浓度下也能促进凝聚体形成，这与表面增强凝聚现象一致。酵母同源蛋白实验表明NDF-FACT凝聚体形成在进化上是保守的。

这些凝聚体表现出独特的生物物理特性：对离子条件敏感，高盐浓度抑制组装；具有可逆性，0.4 M NaCl处理可破坏预形成的凝聚体；对1,6-己二醇处理部分敏感；在升高温度时尺寸减小。荧光漂白恢复（FRAP）实验显示仅20-30%的荧光信号在200秒后恢复，表明材料交换率较低。尽管材料交换有限，这些凝胶样凝聚体仍保持生化活性，能够主动招募Cy2标记的单核小体，并在转录过程中减少核小体特异性暂停。

NDF-FACT凝聚体辅助转录

通过单分子方法，研究人员同时可视化凝聚体形成和转录动力学。高分辨率双陷阱光学镊子实验显示，NDF和FACT共同存在时，SHL-7和-5处的暂停大大减少，SHL-2暂停向下游移动。Lumicks C-Trap系统结合光学镊子和共聚焦荧光显微镜的实验证实，NDF-FACT凝聚体在Pol II附近形成，并在整个转录过程中保持关联。有趣的是，凝聚体随着Pol II在转录过程中移动，表明其与延伸复合物动态关联而非在模板上静止结合。

通过高分辨率光学镊子进行核小体解包装和重包装实验发现，NDF单独显著减少八聚体但产生过多游离DNA，表明组蛋白保留能力差；FACT单独增加六聚体并减少游离DNA；而两种因子结合时保持了约60%的六聚体样物种，同时将八聚体减少约50%，支持了NDF-FACT凝聚体在增强核小体解组装的同时保持染色质完整性的假设。

NDF-FACT凝聚体而非蛋白质相互作用 alone驱动协同增强

通过截短蛋白质绘制NDF的最小相互作用域，研究人员发现两个区域参与结合Spt16：N端PWWP结构域和氨基酸160-180之间的第二个区域。虽然两个结构域都介导与Spt16的蛋白质-蛋白质相互作用，但只有第二个区域是凝聚体形成所必需的。丙氨酸扫描诱变确定了两个保守残基K161和R162对NDF-Spt16相互作用至关重要。在缺乏PWWP的NDF构建体中，将任一残基突变为丙氨酸都会消除其与Spt16的相互作用。

实验证明，这些突变体虽然保留了协助Pol II转录通过核小体的正常催化活性，但未能显示与FACT的协同作用。这种协同作用的丧失与凝聚体形成受损相关，而非蛋白质-蛋白质相互作用破坏，表明凝聚体形成对功能协同是必要的。相反，缺乏PWWP结构域的NDF_F1截短体虽然保留了与FACT形成凝聚体的能力并能将核小体纳入这些凝聚体，但未能表现出协同转录增强。这些结果确定凝聚体形成和催化活性对协同转录延伸都是必需的。

NDF-FACT凝聚体在细胞中形成

利用CRISPR-Cas9技术在人诱导多能干细胞（iPS）系中内源标记NDF和FACT，研究人员发现NDF-mScarlet和Spt16-GFP在活细胞中形成核斑点，且NDF和Spt16斑点大部分共定位。通过细胞骨架（CSK）缓冲液处理去除非染色质结合的核蛋白后，Spt16信号减少90%而NDF基本不受影响，显示了不同的染色质关联特性。在双敲入细胞中，CSK缓冲液处理后观察到NDF-mScarlet和Spt16-GFP斑点的显著共定位。

这些细胞斑点表现出与相分离凝聚体一致的生物物理特性：1,6-己二醇处理显著减少了NDF和Spt16斑点的数量和标准化强度。RNA-FISH实验显示NDF和Spt16斑点与活跃转录的基因（特别是ACTB基因座）共定位，证明其与转录位点的功能关联。FRAP实验显示NDF斑点表现出20-30%的恢复，与体外观察相似，而Spt16斑点几乎不恢复。

NDF-FACT凝聚体对其染色质占据很重要

染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析显示NDF和Spt16占据相同的活性基因，NDF主要富集在转录区域，而Spt16存在于启动子近端和基因体区域。基因组占据模式的K-means聚类分析显示，集群1-3包含活性基因而集群4主要包含非活性基因。

通过1,6-己二醇处理破坏凝聚体形成后，NDF染色质富集在10分钟内急剧减少，这与之前认为NDF定位依赖于PWWP结构域结合H3K36me3的看法相悖。重要的是，LEDGF（另一个结合H3K36me3的PWWP蛋白）不受1,6-己二醇影响，表明1,6-己二醇特异性破坏凝聚体依赖性招募而非PWWP-组蛋白相互作用。

利用auxin（Aux）诱导降解系统，研究人员发现NDF耗竭显著减少了Spt16-mScarlet斑点的数量和强度（约50%减少），表明NDF在FACT斑点形成中起关键作用。Spt16 ChIP-seq显示编码区域Spt16占据显著减少，即使部分NDF耗竭1小时后也很明显。减少的NDF和FACT染色质占据损害了通过染色质的转录，导致Pol II在启动子近端暂停位点积累。

NDF-FACT凝聚体驱动细胞中的转录并维持染色质

通过CRISPR-Cas9构建表达NDF_K161A突变的人iPS细胞，研究人员直接测试了相分离的功能意义。虽然NDF_K161A干细胞仍能存活和多能性，但比同基因野生型（WT）或杂合细胞生长明显减慢。全局转录分析显示NDF_K161A细胞中转录水平在全基因组范围内普遍降低。

PRO-seq数据表明RNA Pol II在NDF_K161A细胞中积累在启动子近端区域，与延伸缺陷一致。TT-seq分析显示NDF_K161A细胞中新生RNA合成速率降低，较短基因受影响更严重，表明NDF-FACT凝聚体可能在较小基因的转录中起更重要作用。DRB释放实验显示NDF_K161A细胞中DRB释放后的新生RNA合成速率和转录延伸速率均降低。

免疫荧光显示NDF_K161A细胞中Spt16斑点数量减少约25%，剩余焦点变暗。使用果蝇 spike-in 标准化的Spt16 ChIP-seq证实转录活跃区域占据显著减少，表明相分离能力而不仅仅是NDF存在对有效FACT染色质招募是必需的。

MNase-seq分析显示NDF_K161A细胞中转录活跃基因座的核小体占据减少。尽管Spt16斑点仅减少约25%，但FACT未能有效与染色质接触导致转录过程中显著的核小体损失。这些发现证明转录过程中适当的核小体维持取决于相分离介导的FACT活性，揭示了凝聚体使FACT能够在人类干细胞转录过程中履行其保持染色质完整性的关键作用的新机制。

研究结论与意义

本研究揭示了相分离介导的机制使NDF和FACT在Pol II转录延伸过程中通过染色质协同作用。研究人员提出了一个模型：在Pol II转录起始和暂停释放后，NDF-FACT凝聚体被招募以支持Pol II通过染色质的进程，可能通过NDF和Pol II之间的相互作用。当Pol II遇到核小体时，凝聚体可以主动纳入核小体，显著增加两种蛋白质的局部停留时间并增强其催化效率。在凝聚体内，NDF destabilizes the nucleosome，使Pol II能够有效绕过SHL-7和SHL-4/5附近的暂停。随着Pol II进入核小体，FACT的相互作用域暴露，使FACT能够与部分解组装的核小体结合并防止DNA重新附着，同时保留组蛋白。这一协调过程降低了Pol II穿越的能量障碍，促进有效延伸同时保持染色质完整性。

这种凝聚体介导的机制可能在更广泛的延伸因子网络中运作。蛋白质组学数据确定了PAF1复合体和Spt5作为NDF相关伙伴，表明延伸凝聚体作为协调多个因子的分子枢纽。此外，与FACT在转录过程中协调的染色质重塑因子如Chd1和组蛋白伴侣如Spt6可能短暂与这些凝聚体关联。鉴于NDF通过其PWWP结构域结合H3K36me3，相分离也可能将组蛋白修饰与转录延伸整合。

为什么需要凝聚体而不是更简单的蛋白质复合物？生理条件下转录延伸所需的速度和效率可能需要这种组织。RNA Pol II在细胞中以约3.5千碱基/分钟的速度转录，需要快速的核小体解组装和重组装。虽然FACT alone可以促进核小体绕过，但它需要延长时间、更高浓度，且在条件下不能有效克服某些暂停位点。NDF介导的相分离提供高局部FACT浓度和促进有效核小体重组的动态环境。在这种背景下，即使对NDF-FACT凝聚体的短暂破坏也会导致细胞中严重的转录缺陷和染色质不稳定性。

本研究发现的NDF-FACT凝聚体机制代表了真核生物转录调控的一个重要突破，不仅解释了长期困扰领域的FACT功能机制问题，也为理解相分离在基因表达调控中的作用提供了新的视角。特别是在干细胞中，这种机制对维持转录稳态和基因组稳定性具有关键意义，可能为未来开发针对FACT的癌症治疗策略提供新的思路和靶点。