ncFN：一个基于全球性和异质性生物分子网络的综合性非编码RNA功能注释框架

《Non-coding RNA Research》：ncFN: a comprehensive non-coding RNA function annotation framework based on a global and heterogeneous biomolecular network

非编码RNA（ncRNA）功能注释框架ncFN基于全局生物分子网络，整合PCG-PCG、ncRNA-PCG和ncRNA-ncRNA三种相互作用，通过随机游走重启（RWR）算法计算ncRNA与PCG的关联强度，结合基因集富集分析（GSEA）实现功能注释。相比现有方法，ncFN覆盖更广的ncRNA类型（miRNA、lncRNA、circRNA）和更大样本量，并在疾病相关功能富集和通路排名中表现更优，提供在线数据库及GitHub代码库。

　　非编码RNA（ncRNA）曾被认为是“垃圾”RNA，因为它们不编码蛋白质。然而，随着研究的深入，越来越多的证据表明，ncRNA在多种生物学过程中发挥着关键作用，例如基因调控、细胞分化以及疾病的发生发展。尽管如此，目前大多数ncRNA的功能仍然不明确，这限制了它们在生物医学研究中的应用。为了应对这一挑战，本研究提出了一种名为ncFN的新框架，用于对多种类型的非编码RNA进行系统性的功能注释。该框架基于一个全局且异质的生物分子网络（Global Interaction Network, GIN），整合了蛋白质编码基因（PCG）之间的相互作用、ncRNA与PCG之间的相互作用，以及不同类型的ncRNA之间的相互作用，从而实现了对ncRNA功能的全面解析。

ncFN的核心在于构建一个包含17,060个PCG和12,616个ncRNA的综合网络，其中涵盖了1,095个微小RNA（miRNA）、3,563个长非编码RNA（lncRNA）以及7,958个环形RNA（circRNA）。这一网络的构建依赖于多个权威数据库，如HumanCyc、KEGG、PANTHER、PID、Reactome等，这些数据库提供了丰富的PCG-PCG相互作用信息。此外，ncRNA与PCG之间的相互作用数据来源于starBase、LncRNA2Target和mirTarBase等数据库，而ncRNA-ncRNA之间的相互作用则主要来自LncBase、starBase和LncRNA2Target等。通过整合这些数据，ncFN不仅涵盖了多种ncRNA类型，还提供了比传统方法更广泛的功能注释范围。

在ncRNA功能注释方面，ncFN采用了一种基于随机游走与重启（Random Walk with Restart, RWR）算法的方法，用于量化ncRNA与PCG之间的关联强度（Association Strengths, ASs）。RWR算法通过模拟随机游走者在网络中的移动过程，计算出ncRNA对整个网络中其他节点（即PCG）的影响力。该算法的关键参数是重启系数（restart coefficient, r），它决定了游走者在探索局部关联与全局扩散之间的平衡。通过测试不同的r值，研究者发现当r设为0.2时，ncFN在三种ncRNA类型（miRNA、lncRNA和circRNA）的疾病通路排名上表现最佳。这一参数的选择确保了ncRNA功能注释的准确性和可靠性。

为了进一步验证ncFN的功能注释结果，研究者采用了两种主要方法：富集分析和疾病通路排名分析。富集分析通过比较ncFN预测的疾病相关ncRNA（PD_ncRNAs）与已知的疾病相关ncRNA（RD_ncRNAs）之间的重叠程度，评估其在疾病通路中的显著性。结果显示，ncFN在16种疾病中均对lncRNA的功能注释表现出显著的富集效应，覆盖率为100%。对于miRNA和circRNA，覆盖率为76%和56%。这表明ncFN在多种ncRNA类型的功能注释上具有较高的准确性和覆盖范围。此外，疾病通路排名分析显示，ncFN在所有三种ncRNA类型中均优于其他现有方法，其结果在统计学上具有显著性（p值小于0.05）。

ncFN不仅在功能注释上表现出色，还支持对多个ncRNA或通路进行富集分析。这种灵活性使得ncFN能够处理更复杂的生物学问题，例如在疾病研究中，同时分析多个差异表达的ncRNA与特定通路之间的关系。通过这种方式，ncFN不仅提供了单个ncRNA的功能预测，还能揭示多个ncRNA协同作用的机制，从而更全面地理解它们在疾病中的潜在作用。

为了方便研究人员使用，ncFN还构建了一个用户友好的在线数据库，该数据库基于Django框架开发，部署在Ubuntu服务器上，并通过NGINX和uWSGI进行优化。数据库采用MySQL作为数据存储系统，并结合结构化文件系统进行管理。为了提升用户体验，ncFN集成了前端组件，如jQuery、DataTables和Cytoscape，以实现更直观的数据可视化和交互功能。此外，ncFN还提供了Python包（如pandas和numpy）用于数据处理和分析，确保了其在计算上的高效性。

在实际应用中，ncFN的功能注释结果得到了多项研究的验证。例如，ncFN成功识别了miR-27a-3p与MAPK信号通路及胰腺癌之间的已知功能关联，同时也揭示了NEAT1与Wnt信号通路及结直肠癌之间的关系。此外，ncFN还能够全面捕捉circ-CPA4在非小细胞肺癌中的多种致癌作用。这些结果不仅证明了ncFN在功能注释上的准确性，也展示了其在不同生物学背景下的适用性。

尽管ncFN在功能注释方面表现出色，但研究者也指出了其存在的局限性。首先，ncFN的性能依赖于基础相互作用数据库的质量和完整性。虽然已经尽可能整合了实验验证的相互作用数据，但仍然存在不可避免的偏差，尤其是在circRNA方面，由于相关数据相对较少，可能导致注释结果的准确性受到影响。因此，未来的研究将致力于整合更全面的circRNA数据，并扩展更多来源的相互作用信息，以构建更加平衡和广泛适用的框架。其次，当前ncFN将网络中的边视为无向边，因为上游和下游的相互作用对于功能推断同样重要。然而，由于现有数据的不完整性，尚未对边进行加权处理。未来的研究计划在更多标准化和全面的数据集出现后，引入加权相互作用，以进一步提升模型的性能。此外，ncFN目前主要依赖于用户定义的参数，如重启系数和富集分析的p值截断点，这些参数可能会影响最终结果。因此，未来的研究将致力于减少参数依赖性，以提高注释的准确性。最后，ncFN当前主要基于KEGG通路进行功能注释，但也可以轻松集成其他功能资源，如Reactome、Gene Ontology和MSigDB等，以增强其在不同生物学背景下的适用性。

在功能注释的未来发展方面，研究者建议可以进一步整合多种类型的数据，例如单细胞或批量RNA测序数据，以构建特定细胞状态或细胞类型的网络，从而更准确地解析ncRNA在不同生物学环境中的功能。此外，尽管ncFN在功能预测方面表现出色，但进一步的实验验证仍然是必要的，以确认其预测的新型功能是否真实存在。通过实验验证，可以进一步提升ncFN的可信度，并推动其在生物医学研究中的应用。

总的来说，ncFN为非编码RNA的功能注释提供了一种全面、高效且可靠的计算框架。它不仅能够处理多种类型的ncRNA，还能通过整合全局的生物分子网络，揭示ncRNA在复杂生物学过程中的潜在作用。ncFN的开发为研究人员提供了一个强大的工具，用于识别与疾病相关的ncRNA，并进一步探索其在疾病机制中的作用。随着更多数据的积累和算法的优化，ncFN有望成为非编码RNA研究领域的重要资源，推动对ncRNA生物学功能的深入理解，并为疾病的诊断和治疗提供新的思路。