三维高复用循环免疫荧光技术揭示人类肿瘤中细胞状态与免疫微空间的完整景观

本研究针对传统薄层组织切片导致细胞完整性缺失、表型鉴定误差大的问题，开发了三维高复用循环免疫荧光（3D CyCIF）技术。通过对30-50μm厚度的FFPE样本进行共聚焦成像，实现了对完整细胞器、细胞膜接触和近分泌信号复合体的精确解析，为肿瘤免疫微环境研究提供了前所未有的空间分辨率和多组学信息。

　　

在肿瘤研究领域，传统组织学分析长期依赖于4-5μm的薄层切片，但这种技术存在根本性局限——绝大多数细胞在切片过程中被切割成碎片，导致细胞表型鉴定错误率高达40%，细胞间相互作用分析严重失真。更令人担忧的是，临床诊断和空间多组学研究都建立在这种不完整的二维信息基础上。《Nature Methods》最新发表的研究通过创新性三维高复用成像技术，彻底改变了这一现状。

研究团队通过将公共领域的循环免疫荧光（CyCIF）方法扩展到三维空间，结合高数值孔径物镜和共聚焦显微镜技术，实现了对30-50μm厚度FFPE样本的高分辨率成像。这种厚度是传统切片的8-10倍，足以容纳完整的细胞层，使研究人员能够以前所未有的细节观察肿瘤、免疫和基质细胞中多种蛋白标志物的准确形态学特征。

关键技术方法包括：使用激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss LSM980）进行光学切片，通过8-18轮循环成像获得20-54重标记图像；结合二次谐波成像（SHG）显示胶原蛋白；利用Imaris软件进行三维重建和可视化；采用SCIMAP软件包进行三维分割和细胞表型分析。样本来源于Brigham and Women's Hospital档案库的黑色素瘤、胶质母细胞瘤、肺转移瘤和扁桃体FFPE标本。

标准5μm组织学切片包含极少完整细胞和细胞核

研究发现，经过脱水处理的FFPE样本在5μm切片后再水化会膨胀至9μm，但即便如此，也只有不到5%的细胞核保持完整。通过比较35μm参考样本和虚拟9μm切片，团队证明薄片成像会导致12%的真实细胞质信号无法检测到相应的细胞核，其中极化蛋白（如LAG3和MX1）的假阴性率高达30-40%。

肿瘤微结构

在黑色素瘤原位（MIS）和垂直生长期（VGP）样本中，细胞呈现紧密排列的特点。细胞核平均直径5.0μm，细胞主要轴平均长度13μm，次要轴6.1μm。胞质区深度（从质膜到核纤层的距离）通常为1-6μm，相邻细胞膜间距约1μm。研究发现某些细胞具有高度延伸的细胞体和细胞质突起，如转移性黑色素瘤中的CD8⁺ T细胞可延伸出5-10μm的丝状伪足。

血管和跨内皮迁移

三维成像揭示了传统二维无法观察到的微结构组件，如MIS中一个100μm长的真皮血管段。研究发现B细胞最可能与真皮中的胶原纤维密切关联，并经常（14个中有11个）被拉伸成不规则形状，这为B细胞在皮肤中的功能提供了直接证据。

细胞器和细胞表面形态

高复用成像揭示了各种各样的独特细胞内和质膜结构，包括谱系相关的核纤层差异（如中性粒细胞中的多叶核）、微管组织中心、过氧化物酶体（基于过氧化氢酶染色）、分泌颗粒和/或内质网（中性粒细胞中的溶菌酶C和T细胞中的颗粒酶B）、DNA损伤灶（γH2AX）、线粒体（COXIV）和生物分子凝聚体（MX1）。

功能性肿瘤-免疫相互作用

细胞表面蛋白分布的变化揭示了功能性接触。免疫检查点受体PD-1及其跨膜配体PD-L1从相对均匀的膜分布到点状分布的变化最为明显，当PD-1⁺ T细胞与表达PD-L1的细胞（主要是树突状细胞）接触时，点状形态最为明显。

肿瘤谱系可塑性

在黑色素瘤原位区域，大多数黑色素细胞位于真皮-表皮连接处（DEJ），与角质形成细胞相互作用并保持树突状形态。相比之下，Paget样扩散的黑色素细胞具有阿米巴样形态但缺乏树突，位于表皮顶部。研究发现这些细胞表达多种不同的谱系标志物组合，表明早期恶性转化的黑色素细胞经历了频繁的细胞状态变化（表型可塑性），而不是从单个转化细胞或祖细胞进行渐进进化。

炎症微环境

黑色素瘤原位包含多个空间上不同的炎症信号域，直径约50-100μm，表现出干扰素（IFN）应答蛋白（如IRF1、MX1和MHC-I）的水平或分布升高。这些IFN阳性空间生态位与上述谱系转换同时发生，但没有可检测到的空间相关性。

祖细胞和T细胞亚群

通过十个T细胞谱系和状态标志物对转移性黑色素瘤进行深度三维免疫分析，揭示了群体的多样性和状态。其中，祖细胞耗竭T（T_PEX）细胞特别令人感兴趣，因为它们可以通过免疫检查点抑制剂重新激活，它们的存在与改善患者预后相关。

膜-膜相互作用

基于核位置的接近性分析现有方法只能近似识别细胞-细胞相互作用，而高分辨率成像使得直接研究膜-膜相互作用成为可能。研究观察到三种基于膜-膜接近程度和范围的排列：（1）直接结合（I型相互作用），（2）膜对接（II型相互作用）和（3）邻域聚类（III型相互作用）。

研究发现，不同类型的膜-膜相互作用经常共存。一个由11个细胞组成的群落中，包含了I型、II型和III型相互作用的复杂网络，表明单个免疫或肿瘤细胞可以与多个不同类型的其他细胞建立密切接触。

这项研究通过三维高复用组织成像技术，为解决传统组织学分析的局限性提供了突破性解决方案。研究不仅揭示了薄层切片导致细胞完整性缺失的根本问题，更重要的是开发了一种能够对完整细胞、细胞器和局部社区进行精确分析的技术方法。

研究发现，仅通过将切片厚度增加四到五倍（达到水化后30-40μm厚度），并进行光学切片，就能够克服细胞碎片化问题，研究各种细胞类型和组织中的细胞器、凝聚物、细胞骨架和其他亚细胞结构。这种厚切片方法可能在研究细胞、其组成及其局部社区方面代表着一个"最佳点"，因为它平衡了分辨率、复用性和组织完整性。

该技术的意义远不止于技术本身：它使得基于并置的膜-膜接触而不是细胞（核）质心的接近性来研究细胞-细胞接触成为可能；纠正了由于细胞内蛋白质极化或沿成像轴细胞重叠而导致的标志物表达状态错误分配；为研究同时存在互补和相反调节信号的多细胞社区提供了可能。

虽然三维组织成像不太可能取代二维方法，特别是在涉及大样本集的转化研究中，但即使有限数量的准确三维数据集也将使纠正二维图像的局限性成为可能，并识别单独在二维图像中不易辨别的组织新特征。正如立体学一样，这些数据将为更准确地理解组织结构和功能提供重要基础。

这项研究标志着空间蛋白质组学领域的一个重要里程碑，为未来肿瘤微环境研究、免疫治疗反应机制探索以及临床诊断准确性提升提供了强大的技术平台和新的研究方向。