基于三元普鲁士蓝纳米酶协同催化作用的超灵敏侧向流动免疫分析技术用于呼吸道合胞病毒诊断

本研究针对呼吸道合胞病毒（RSV）早期诊断灵敏度不足的问题，开发了一种基于Fe/Co/Ni三元金属有机框架纳米酶的新型侧向流动免疫分析（LFIA）技术。该平台通过协同多金属催化作用显著增强过氧化物酶样活性，对重组RSV N蛋白检测限达5 pg/mL，对活病毒检测灵敏度较金纳米粒子LFIA提升1000倍，为RSV现场快速检测提供了高效解决方案。

　　

呼吸道合胞病毒（RSV）作为婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，全球范围内造成显著的发病率和死亡率。早期准确诊断对有效治疗和疾病管理至关重要。然而，传统诊断方法如病毒培养、RT-qPCR和免疫分析存在成本高、耗时长、需要专业设备等局限性，限制了在即时检测（POCT）场景的应用。侧向流动免疫分析（LFIA）以其操作简便、检测快速、成本低廉等优势成为现场检测的重要平台，但传统金纳米粒子（AuNP）基LFIA存在灵敏度有限和特异性不足的缺陷，难以检测低丰度靶标。

为突破这些技术瓶颈，研究人员将目光投向纳米酶增强型LFIA技术。虽然贵金属、碳基纳米结构和金属有机框架等材料已被用于信号放大，但传统纳米酶往往存在电子传递效率有限和催化活性不足的问题。普鲁士蓝（PB）纳米酶因其优异稳定性、良好表面特性和出色的过氧化物酶样活性而备受关注，但单元素PB纳米酶通常具有高米氏常数（K_m）和低最大反应速率（V_max），限制了其催化性能。

在这项发表于《Sensors and Actuators Reports》的研究中，Dinglin Fan、Zhen Ren等研究人员开发了一种创新的三元金属有机框架（MOF）纳米酶增强LFIA平台，用于RSV的超灵敏和特异性检测。该研究通过合理设计Fe/Co/Ni三元PB衍生MOF纳米酶，实现了协同多金属催化作用，显著提升了检测性能。

研究采用的主要关键技术包括：通过一锅共沉淀法合成二元和三元MOF纳米酶；利用透射电镜和能量色散谱进行纳米材料表征；通过稳态动力学分析评估催化活性；采用被动吸附法将抗RSV单克隆抗体功能化到纳米酶表面；优化LFIA试纸条制备参数；使用便携式免疫分析仪进行定量评估。病毒样本来自实验室培养的RSV病毒株。

3.1. 三元MOF LFIA的设计与操作

研究人员设计了一种新型三元MOF基LFIA用于快速超灵敏RSV检测。三元MOF纳米酶通过一锅沉淀法合成：将含Fe³⁺的溶液A加入到含Co²⁺和Ni²⁺的溶液B中，成功合成了平均粒径约60 nm的三元MOF。通过静电相互作用将抗RSV IgG吸附到三元MOF上，使纳米酶功能化具有RSV检测特异性。检测过程中，目标物与标记纳米酶特异性结合后加样到样品垫上，液体通过毛细作用沿硝酸纤维素膜向上迁移，免疫复合物被检测线上的抗体捕获形成夹心结构。

3.2. 抗RSV N单克隆抗体的表征

通过BALB/c小鼠免疫方案成功制备了针对RSV核衣壳蛋白的单克隆抗体。重组RSV-N（rRSV-N）蛋白在大肠杆菌XL1-blue中表达，经Co-NTA亲和柱纯化，SDS-PAGE显示单一46 kDa蛋白条带。Western blot和间接免疫荧光分析证实抗体对rRSV-N蛋白具有特异性结合，与流感病毒、SARS-CoV-2、裂谷热病毒和发热伴血小板减少综合征病毒无交叉反应。

3.3. 三元MOF的表征

透射电镜显示三元MOF呈立方体形状，分散性良好，尺寸均匀。能量色散谱分析证实纳米酶颗粒主要成分为Fe、Co和Ni元素， mapping显示这些元素在立方MOF结构内均匀分布。抗体功能化后在纳米粒子表面观察到明显光晕，表明抗体成功偶联。抗体偶联效率在88.9%至93.3%之间，显示高效固定化。

3.4. 三元MOF的催化活性

评估显示三元MOF具有显著的过氧化物酶样活性，能催化TMB和DAB底物氧化。与二元（Fe/Co和Fe/Ni）MOF相比，三元Fe/Co/Ni MOF性能更优，表明第三种金属离子的引入进一步放大了电子传递和活性位点协同作用。催化活性显示明显pH依赖性，最适pH为6。比活性计算显示Fe/Co/Ni MOF达到4.196 U mg^?1，稳态动力学分析显示其对TMB氧化的K_m为0.121 mM，证实其催化活性优于二元体系。

3.5. 三元MOF基LFIA用于RSV检测的可行性

评估显示rRSV-N蛋白和病毒上清液在检测系统中均产生明显显色信号，DAB底物加入后信号增强，空白样品无颜色变化，证实RSV检测成功。扫描电镜分析显示三元MOF-LFIA比AuNP基LFIA形成更密集紧凑的复合物，DAB底物加入进一步放大这些复合物信号。

3.6. LFIA参数的优化

系统优化了K₂CO₃体积、抗RSV mAb载量、孵育时间和MOF浓度等关键参数。确定40 μL K₂CO₃、40 μg mAb、6分钟孵育时间和4 mg/mL三元MOF为最优条件，确保稳健和可重复的诊断性能。

3.7. 三元MOF基LFIA试条的灵敏度

灵敏度评估显示，rRSV-N蛋白浓度从0到100,000 pg/mL范围内，NC膜上出现梯状比色信号。AuNP基LFIA对rRSV-N蛋白的视觉检测限为2 ng/mL，而三元MOF-LFIA与DAB底物显示视觉检测限为5 pg/mL，灵敏度提高400倍。

3.8. LFIA的特异性和稳定性

特异性评估显示，对rSARS-CoV-2-N蛋白、rRVFV-N蛋白、rSFTSV-N蛋白、IAV、SARS-CoV-2、RVFV或SFTSV等非目标样品，T线无 noticeable颜色变化，而rRSV-N蛋白和活RSV产生明显显色信号，证实对RSV检测的高特异性。稳定性测试显示，试条在室温储存六个月后仍保持强且一致的测试线强度。

3.9. 活RSV的传感性能分析

临床效用验证显示，AuNP基LFIA的视觉检测限为10^?4稀释度（相当于10^3.875 TCID₅₀/mL），而MOF基LFIA达到10^–7稀释度（相当于10^0.875 TCID₅₀/mL）的检测限，灵敏度提高1000倍。RT?qPCR（靶向RSV N基因）显示在10^?9稀释度时Ct值超过35周期，比三元MOF-LFIA检测限高约10倍。

研究结论表明，通过整合靶向保守N蛋白的单克隆抗体与三元PB衍生MOF纳米酶，成功开发了视觉RSV检测生物传感器。凭借三元MOF的高催化活性和抗体优异特异性，所提出的LFIA展现出卓越的分析性能，对rRSV-N蛋白检测限达5 pg/mL，对活RSV检测限为10^0.875 TCID₅₀/mL，与RT–qPCR高度一致。虽然绝对灵敏度仍略低于RT–qPCR，但该平台具有便携性、成本效益和用户友好性等显著优势，适用于现场诊断。由于其模块化设计，该平台可轻松适配其他呼吸道病原体，为多重诊断工具提供坚实基础。未来工作应聚焦于多重检测能力和更大临床样本的性能验证，增强其在真实场景中传染病监测和即时检测的实用性。

该研究的重要意义在于首次将三元金属协同催化概念引入RSV诊断领域，通过合理设计多金属MOF纳米酶，实现了信号放大效应的数量级提升。相比传统单元素纳米酶，三元体系通过增加活性位点密度和促进协同电子传递，显著增强了催化效率。这项技术不仅为RSV早期诊断提供了新解决方案，也为其他传染病快速检测平台开发提供了新思路，特别是在资源有限地区和应用场景中具有重要推广价值。