基于单颗粒电感耦合等离子体质谱(SP-ICP-MS)和hOGG1酶介导的均相传感平台实现多重DNA甲基化检测及其在结直肠癌诊断中的应用

本研究针对复杂临床样本中多重DNA甲基化检测灵敏度低、操作繁琐的问题，开发了一种基于金纳米粒子(AuNPs)组装和单颗粒电感耦合等离子体质谱(SP-ICP-MS)的均相传感新方法。通过hOGG1酶特异性识别8-oxoG/mC复合物并切割Linker探针，调控AuNPs聚集状态，实现了对甲基化MLH1和MGMT的双模式检测，检测限达25.0 pM和10.0 pM。该方法成功应用于34%人血清样本和结直肠癌细胞系分析，为疾病机制研究和临床诊断提供了新技术平台。

　　

在生命科学和医学研究领域，DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在基因表达调控和细胞功能决定中发挥着关键作用。特别是在结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)等疾病中，多种肿瘤相关基因的异常甲基化与疾病发生发展密切相关。然而，传统DNA甲基化检测方法如甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐测序等技术存在操作复杂、检测通量低、易受样本基质干扰等局限性，难以满足临床样本中多重低丰度甲基化标志物的检测需求。

针对这一挑战，研究人员创新性地将亚硫酸氢盐转化技术与单颗粒电感耦合等离子体质谱(Single-Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, SP-ICP-MS)相结合，开发了一种新型均相传感平台。该平台通过模块化的Linker探针设计，实现了对多重DNA甲基化标志物的高灵敏、高特异性检测。

研究采用了几项关键技术方法：首先构建了DNA修饰的金纳米粒子(AuNPs)探针，通过巯基化DNA与AuNPs的表面偶联制备了功能化纳米探针；其次利用亚硫酸氢盐处理技术特异性区分甲基化和非甲基化胞嘧啶；最关键的是采用hOGG1酶特异性识别8-oxoG/mC复合物并切割Linker探针的反应机制；最后通过SP-ICP-MS技术检测AuNPs聚集状态变化产生的脉冲信号差异。研究使用了34%人血清样本和四种细胞系(NCM460、SW480、HCT116、Caco-2)的基因组DNA作为实际样本进行方法验证。

3.1. Construction of the SP-ICP-MS sensing platform

研究人员成功合成了粒径约35 nm的单分散金纳米粒子，并通过紫外-可见光谱、动态光散射和zeta电位等表征手段证实了SH-DNA与AuNPs的成功偶联。优化后的Linker探针浓度为10 nM，AuNPs探针浓度为20 pM，其与linker链的解离常数(K_d)分别为2.46×10^-9 M和3.23×10^-9 M，表明具有良好的结合亲和力。

3.2. Investigation of the homogeneous reaction for DNA methylation detection

以甲基化MLH1为模型靶标，研究证实hOGG1酶能够特异性识别8-oxoG/mC复合物并切割Linker探针，而8-oxoG/U复合物则不会被切割。变性凝胶电泳结果验证了这一特异性识别机制。SP-ICP-MS检测显示，甲基化MLH1的存在导致AuNPs聚集减少，产生低强度、高频率的脉冲信号。

3.3. Sensing performance evaluation of the SP-ICP-MS assay

在最优条件下，甲基化MLH1的检测线性范围为25 pM-2.5 nM，强度模式和频率模式的定量限(LOQ)均为25.0 pM，相对标准偏差(RSD)分别为3.5%和6.8%。该方法最低可检测0.04%的甲基化比例，比传统PCR技术提高了约三个数量级。特异性实验表明，该方法对非靶标核酸分子具有良好的抗干扰能力。

3.4. Universality of the DNA methylation sensing platform

通过简单更换Linker探针的靶标识别区域，该方法成功应用于甲基化MGMT的检测，其线性范围为10 pM-2.5 nM，LOQ为10.0 pM。在34%人血清样本中的加标回收率为94%-105%，RSD为3.21%-8.37%，表明方法具有良好的准确度和精密度。

3.5. Multiplexed DNA methylation assay in biological matrixes

该方法成功应用于结直肠癌细胞系中甲基化MLH1和MGMT的检测。结果显示，与正常结肠上皮细胞NCM460相比，三种CRC细胞(SW480、HCT116、Caco-2)均表现出显著升高的甲基化水平。其中SW480细胞甲基化MLH1表达水平较高，而Caco-2细胞两种甲基化标志物水平均较高。临床血浆样本分析表明，MLH1-mC和MGMT-mC联合检测的AUC值达到0.98，特异性100%，灵敏度80%，准确度90%，显著提高了结直肠癌的诊断可靠性。

本研究成功开发了一种基于hOGG1酶介导和SP-ICP-MS检测的均相传感平台，实现了对多重DNA甲基化标志物的高灵敏、高特异性检测。该方法具有几个显著优势：首先，通过双模式(强度和频率)检测策略提高了结果的可靠性和准确性；其次，模块化的探针设计使方法具有良好的通用性和可扩展性；最后，方法在复杂生物样本中表现出的优异性能使其具备临床转化潜力。

该研究的创新之处在于巧妙地将酶特异性识别与纳米粒子组装信号放大相结合，利用SP-ICP-MS技术解决了传统光学方法存在的信号重叠和基质干扰问题。特别是0.04%的超低甲基化比例检测能力，为早期癌症诊断提供了技术可能。多重检测能力的实现使得对疾病相关表观遗传变化的系统分析成为可能，有助于深入理解癌症发生发展的分子机制。

这项技术不仅为DNA甲基化检测提供了新的方法学工具，更重要的是为结直肠癌的早期诊断和精准分型提供了有前景的技术方案。其均相检测的特性和良好的抗干扰能力，使其特别适合复杂临床样本的高通量分析，在疾病分子诊断和表观遗传学研究领域具有广泛的应用前景。