基于比较基因组学与生物信息学分析揭示Geobacillus属的益生潜力：从极端环境到肠道健康的新视角

本研究通过比较基因组学与生物信息学方法，系统评估了嗜热菌Geobacillus属的益生潜力。研究人员分析了18个Geobacillus菌株的基因组特征，发现该属具备耐受胃肠道环境、产生免疫调节化合物和营养因子的能力，且缺乏毒力因子和抗生素抗性基因。研究揭示了Geobacillus属具有开放的泛基因组结构，富含碳水化合物活性酶(CAZymes)和CRISPR-Cas系统，表明其作为新型益生菌候选者的巨大潜力，为开发下一代益生菌提供了新方向。

　　

在地球上各种极端环境中，存在着一种被称为嗜极微生物的特殊生命形式，它们借助进化适应在各种严酷条件下繁衍生息。其中，Geobacillus属作为一类专性嗜热、革兰氏阳性杆状细菌，能够在45-80°C的高温环境中生长，最适生长温度达55-65°C。这些微生物栖息地异常多样，从寒冷的南极环境到极端炎热的地热泉和赤道沙漠都能发现它们的踪迹。

长期以来，Geobacillus属因其出色的耐热特性而在生物技术领域展现出重要价值。它们被广泛用于生产热稳定蛋白，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等具有强大催化活性的酶类，同时在生物加工应用中扮演关键角色，包括生物燃料和生物柴油的生产以及生物修复过程。然而，尽管其在工业应用中备受关注，关于Geobacillus属益生潜力的研究却相对缺乏。

随着全球抗生素耐药性问题日益严重，寻找具有增强益生特性的新型菌株需求不断增长。厚壁菌门中的Geobacillus和Parageobacillus因其能够产生抗菌化合物（如细菌素、抗生素和细菌素样抑制物质）而受到关注，成为有前景的益生菌候选者。这些菌株通过形成耐久的内生孢子等特殊生存策略，使其能够在高温和紫外线辐射等极端条件下存活，这使它们成为人类、动物和环境微生物组中强大的益生菌候选者。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员采用比较基因组学和生物信息学方法，对Geobacillus属的益生潜力进行了全面评估。研究团队选取了18个Geobacillus菌株（包括13个有效发表物种和5个随机选择基因组），并以乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)等已知益生菌作为对照，系统分析了这些菌株的基因组特征。

研究采用了多种关键技术方法：通过QUAST和CheckM进行基因组质量评估与修剪；使用Bowtie2进行多全基因组序列比对；利用Species Tree Builder和BV-BRC平台进行系统基因组分析；通过Prokka进行基因组注释；运用PlasmidFinder、Phigaro、ICEFinder等工具预测移动遗传元件；采用ABRIcate、RGI、CARD等数据库分析抗生素抗性基因；通过dbCAN鉴定碳水化合物活性酶(CAZymes)；最后使用KBase平台的多种工具进行泛基因组分析。所有分析菌株均来自公开数据库，包括NCBI数据集中的Geobacillus菌株以及作为对照的益生菌菌株。

基因组质量与基本特征

研究涉及的18个Geobacillus菌株基因组质量良好，完整度超过97%，污染率极低。Geobacillus基因组的GC含量在49-53%之间，总基因组长度(3.45-3.80 Mb)高于乳酸杆菌(2.03-3.2 Mb)和双歧杆菌(2.23-2.83 Mb)。大多数Geobacillus菌株分离自石油田、热泉、喷气孔和沉积物等环境，而Geobacillus stearothermophilus ATCC 12980和Geobacillus thermodenitrificans DSM 465则分离自腐败罐头食品和甜菜汁。

系统基因组学与功能分析

平均核苷酸一致性(ANI)分析显示，Geobacillus基因组间具有90-100%的高度核苷酸一致性。基于49个核心直系同源基因群(COG)基因家族和单拷贝BV-BRC PGFams的系统发育分析将Geobacillus与乳酸杆菌和双歧杆菌明显区分开。功能评估显示，所有基因组中未表征的子系统包括次级代谢物生物合成、运输、分解代谢、细胞内运输、分泌、染色质结构和动力学、细胞骨架以及RNA加工和修饰。细胞运动性在乳酸杆菌和双歧杆菌中缺失，而在Geobacillus属中存在。

益生相关基因的鉴定

研究检测了与免疫系统调节、维生素生物合成、脂肪酸合成、应激条件耐受（酸/胆汁、渗透、氧化应激）、粘附、细菌定植和分子伴侣相关的基因。发现在所有基因组中均存在25个免疫调节基因，如pyrC、pyrE、pyrH、pyrB、pyrG、pyrK、txrA、txrB、clpB、cysC、nrdR等。粘附相关基因tuf、clpB、clpX和clpC在所有基因组中存在，而comC、srtD、pilT、pilZ和lapA仅存在于Geobacillus基因组中。所有基因组中都存在酸应激相关基因，如atpB、atpC、atpD、atpE、atpF、atpG、atpH、recA、sodA、luxS、glmU、glmS、glmM1、glmM2和asps。渗透应激相关基因在双歧杆菌和乳酸杆菌基因组中缺失，但opuD和opuC存在于某些Geobacillus基因组中，opuCA、opuCB和opuCC仅存在于Geobacillus基因组中。

安全相关特征评估

研究发现只有少数抗生素抗性基因（如vanY、vanT和rpoB）存在于所有基因组中。未发现任何毒素相关基因，仅在一些Geobacillus基因组中预测到少数毒素样蛋白（如PhoH、MazF、HicA和PemK基因）。在所有研究的基因组中均未发现毒力因子。移动遗传元件在所有基因组中缺失，仅在B. brevis中存在少量移动元件。在所有基因组中未发现质粒。

细菌素、前噬菌体和CRISPR-Cas系统

在各种Geobacillus基因组中存在多种细菌素，如Circularin_A、ComX1、ComX4、Salivaricin_D、Sactipeptides、Pumilarin和Geobacillin_I_like等。在18个Geobacillus基因组中，11个含有主要属于Myoviridae和Siphoviridae家族的前噬菌体。进一步表征发现，这些前噬菌体不编码任何抗生素抗性和毒素，除Geobacillus sp. C56-T3 NC_014206中的一个前噬菌体外，其他均不编码毒力因子。CRISPR-Cas系统仅存在于Geobacillus基因组中，包括cas1、cas2、cas3、cas4、cas5h、cas6、cas9、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5和cmr6等基因。

碳水化合物活性酶(CAZyme)分析

碳水化合物活性酶在所有基因组中均存在，其中糖苷水解酶含量丰富，存在多种糖苷水解酶类别（GH1、GH13、GH13_1、GH13_2、GH13_4、GH13_10、GH13_12、GH13_13、GH13_14、GH13_20、GH13_21、GH13_23、GH13_29、GH13_31、GH13_36、GH13_37、GH13_39、GH13_41和GH18）。糖基转移酶GT2、GT4、GT51和GT108也存在较多。在所有基因组中均未发现多糖裂解酶。

泛基因组分析

对23个基因组（18个Geobacillus、3个乳酸杆菌和2个双歧杆菌）的泛基因组分析显示了38393个蛋白质编码基因（含翻译），30702个同源家族基因和7691个单例家族基因。仅针对Geobacillus属的泛基因组分析显示了25284个蛋白质编码基因，23504个同源家族基因和1680个单例家族基因。Geobacillus的核心泛基因组稀疏曲线显示，随着每个添加的基因组，基因簇数量不断增加，表明Geobacillus泛基因组是一个开放的泛基因组。

研究结论表明，Geobacillus属通过比较基因组学分析显示出其潜在的益生菌特性。该属具备耐受胃肠道环境、产生免疫调节化合物和营养因子的能力。安全评估显示缺乏移动遗传元件、毒力因子和抗生素抗性基因，但存在CRISPR-Cas系统和碳水化合物活性酶。泛基因组分析揭示了Geobacillus属具有开放的泛基因组结构，核心基因组中包含基本功能基因，而与环境相互作用或次级代谢物合成相关的基因更常见于泛基因组中。

这项研究的重要意义在于首次通过系统性的比较基因组学方法全面评估了Geobacillus属作为益生菌候选者的潜力。研究发现该属具有多种益生特性相关基因，包括应激耐受、粘附定植、免疫调节等功能，同时缺乏安全风险相关的移动遗传元件和抗生素抗性基因。特别是CRISPR-Cas系统的存在为其提供了对抗噬菌体的防御机制，而丰富的碳水化合物活性酶则表明其具有利用复杂碳水化合物的能力。这些发现为开发基于极端微生物的新型益生菌制剂提供了理论基础，拓展了益生菌资源的开发范围，为应对抗生素耐药性问题提供了新的解决方案。然而，研究人员也强调，需要进一步的体外研究来验证这些发现并确认其益生潜力。