M464通过抑制NLRP3炎症小体激活缓解小鼠急性肝肺损伤的新型硫化氢释放型NSAIDs研究

本研究针对传统非甾体抗炎药(NSAIDs)长期使用导致的胃肠道副作用问题，开发了一种新型硫化氢(H2S)释放型化合物M464。通过体内外实验证实，M464能有效抑制NLRP3炎症小体激活，降低Caspase-1切割和IL-1β成熟，减少ROS生成和ASC寡聚化，显著改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤和LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤。该研究为NLRP3相关炎症疾病提供了新的治疗策略，具有重要的临床转化价值。

　　

在医学领域，非甾体抗炎药(NSAIDs)一直是治疗疼痛和炎症的主力军，从头痛脑热到关节炎发作，都离不开它们的身影。然而，这些药物就像一把双刃剑——在缓解症状的同时，也可能给患者带来胃肠道出血和溃疡等副作用，使得长期使用成为临床难题。虽然科学家们陆续开发了选择性COX-2抑制剂和一氧化氮释放型NSAIDs等新型药物，但它们要么存在心血管风险，要么安全性尚未明确，远未满足临床需求。

近年来，一种曾经让人掩鼻的臭气分子——硫化氢(H₂S)引起了研究人员的极大兴趣。原来，这种气体信号分子在人体内发挥着重要的生理功能，不仅能够扩张血管、降低血压，还具有抗氧化和抗炎特性。更令人惊喜的是，H₂S能够抑制核因子κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等炎症信号通路的激活，从而减少炎症介质的产生。这为开发新型抗炎药物提供了全新思路。

与此同时，科学家们将目光投向了免疫系统中的重要组件——NLRP3炎症小体。这个由NOD样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和Caspase-1组成的多蛋白复合物，是先天免疫系统的关键调控者。当感受到感染、细胞损伤或压力等危险信号时，NLRP3炎症小体就会被激活，促进Caspase-1的自我切割，进而导致促炎因子IL-1β/18的分泌。同时，Caspase-1还会切割gasdermin D(GSDMD)，产生N端GSDMD(N-GSDMD)，在细胞膜上形成孔洞，引起细胞焦亡，释放更多的炎症细胞因子。

NLRP3炎症小体信号通路的失调与多种人类自身免疫性疾病、炎症性疾病和代谢性疾病的发病机制有关，包括系统性红斑狼疮、关节炎和糖尿病等。尽管MCC950等NLRP3炎症小体抑制剂在临床前研究中显示出强大的抗炎活性，但其胃肠道毒性和对中枢神经系统的影响限制了临床应用。因此，寻找安全有效的NLRP3炎症小体抑制剂成为当务之急。

基于以上背景，南京师范大学鼓楼医院生命健康研究中心的徐广林教授团队合成了一种新型的H_{22S释放型非甾体抗炎化合物M464，并深入研究了其抗炎作用及具体机制。研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上，为NLRP3相关炎症疾病的治疗提供了新的候选化合物。}

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定和碘化丙啶(PI)染色评估细胞焦亡；使用蛋白质免疫印迹(Western Blotting)和酶联免疫吸附测定(ELISA)分析蛋白表达和细胞因子分泌；采用免疫荧光技术检测活性氧(ROS)生成和ASC斑点形成；通过二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)交联实验分析ASC寡聚化；建立LPS诱导的急性肺损伤和LPS/D-半乳糖胺(D-GalN)诱导的急性肝损伤小鼠模型进行体内验证；使用组织学评估、病理分析和血清指标分析评估组织损伤程度。

研究结果显示，M464能够显著抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。在J774A.1和小鼠巨噬细胞和THP-1人单核细胞中，M464剂量依赖性地减少了PI染色阳性细胞数量和LDH释放，表明其有效抑制了NLRP3炎症小体激活剂诱导的细胞死亡。

进一步机制研究表明，M464能够抑制NLRP3炎症小体的激活。Western Blotting分析显示，M464剂量依赖性地降低了成熟IL-1β(17KD)和Caspase-1的表达水平，而对Pro-IL-1β和Pro-Caspase-1的表达水平影响不大。ELISA实验结果也证实，M464剂量依赖性地抑制了J774A.1巨噬细胞上清液中IL-1β的释放。

M464还能够抑制细胞内ROS的产生和ASC寡聚体的形成。细胞免疫荧光实验显示，M464剂量依赖性地降低了ROS水平。DSS交联实验和免疫荧光检测表明，M464能够显著抑制ASC寡聚体的形成，在高剂量组(12μM)效果尤为明显。

在体内实验中，M464能够缓解LPS诱导的小鼠急性肺损伤。组织学评估显示，M464剂量依赖性地降低了肺损伤的病理评分，显著改善了小鼠肺组织损伤。肺湿重/干重(W/D)比值测定表明，M464和阳性对照地塞米松(DXM)都能抑制这一比值的升高，显著改善小鼠肺水肿。

M464还能缓解LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤。大体检查显示，LPS/D-GalN诱导组小鼠肝脏出现明显充血和严重损伤，而M464和DXM都能显著改善肝损伤。肝脏/体重比值在LPS/D-GalN诱导组显著增加，而阳性药DXM和高剂量组能够使这一比值恢复正常。

HE染色显示，LPS/D-GalN诱导组小鼠肝组织表现出明显的结构紊乱、肝组织出血、广泛的肝细胞坏死和炎症细胞浸润。然而，给予M464或DXM治疗后，这些病理变化得到明显改善。血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平评估表明，与对照组相比，LPS/D-GalN诱导组这些肝酶显著升高，M464呈剂量依赖性抑制这些肝酶。

氧化应激分析显示，与对照组相比，LPS/D-GalN诱导组超氧化物歧化酶(SOD)含量显著降低，丙二醛(MDA)水平显著升高。M464有效逆转了这些变化，表明其对氧化应激具有强大的抑制作用。

Western Blotting和ELISA实验表明，LPS联合D-GalN刺激后，成熟IL-1β释放和Caspase-1产生显著增强。然而，M464有效抑制了这些反应，且呈剂量依赖性。RT-PCR实验发现，M464给药能够降低LPS/D-GalN诱导组升高的IL-1β和Caspase-1 mRNA水平，这与Western Blotting结果一致。免疫组化结果也显示，LPS/D-GalN诱导组有明显的染色斑点，而阳性DXM组和高剂量M464组则相反，这足够支持细胞实验的结果。

研究结论与讨论部分指出，新型硫化氢释放型非甾体抗炎药M464通过在体内缓慢释放气体信号分子H₂S，解决了传统NSAIDs长期或大量使用对胃肠系统和心血管系统的不良影响。这些药物不仅减轻了副作用，而且表现出与母体化合物相当或更强的药理活性。

本研究首次揭示了M464通过抑制NLRP3炎症小体发挥抗炎作用的潜力。体外实验证明，M464有效抑制了NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡，并剂量依赖性地降低了细胞上清液中IL-1β和Caspase-1的表达，表明显著抑制了NLRP3炎症小体的激活。机制研究表明，M464抑制了ASC寡聚体的形成。先前的研究表明活性氧(ROS)是促进NLRP3炎症小体激活的上游刺激因子，本研究结果显示M464剂量依赖性地抑制ROS的产生。因此，M464成为通过靶向ASC寡聚体形成和细胞内ROS产生来抑制NLRP3炎症小体激活的化合物。

在LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤模型中，研究发现M464降低了肝组织中caspase-1和IL-1β mRNA水平。这种效应可能与M464释放的H₂S有关。先前的研究表明，H₂S可以通过调节IL-1β和caspase-1的mRNA水平来保护视网膜色素上皮(RPE)细胞免受高葡萄糖诱导的损伤。同样，在脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤模型中，H₂S显著降低了IL-1β和其他细胞因子的mRNA表达，并对急性肺损伤具有保护作用。尽管H₂S可以通过多种方式直接或间接调节炎症性疾病，但本研究结果表明，M464至少部分通过H₂S介导的IL-1β和caspase-1 mRNA水平发挥其抗炎作用。其他氢释放剂也观察到了M464对此类细胞因子的调节功效。

多项研究表明，LPS刺激巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活，从而促进炎症因子IL-1β的产生，导致炎症反应的发生，这参与了急性肝肺损伤的病理机制。在本研究的肺损伤模型中，M464能够有效降低肺部湿重/干重比，改善炎症细胞浸润和肺泡结构紊乱，显著减轻肺部病理损伤。同时，M464能够减少激活的Caspase-1和IL-1β的释放，有效抑制NLRP3炎症小体的激活。在肝损伤模型中，M464能够有效降低肝脏器官比，改善肝脏出血、肝细胞紊乱和炎症细胞浸润。降低ALT和AST水平，在一定程度上恢复肝功能。在组织中，M464降低了Caspase-1和IL-1β蛋白或基因表达水平，从而抑制了NLRP3炎症小体的激活。本研究发现，M464能够提高急性肝损伤模型中的SOD含量，降低MDA水平，有效缓解氧化应激。

总之，M464通过抑制ASC寡聚化和减少ROS产生，有效阻碍了下游Caspase-1表达的激活和IL-1β的释放。这种双重作用在体外和体内都表现出强大的抗炎效果。这些发现强调了M464作为治疗NLRP3相关炎症性疾病的新型先导化合物的潜力，为该领域的治疗干预提供了广阔前景。