超高密度Neuropixels Ultra探针革新神经元记录：提升检测灵敏度、细胞分类精度与亚细胞结构解析能力

为解决传统电极空间分辨率不足导致的神经元检测偏差和细胞类型鉴别难题，研究人员开发了超高密度Neuropixels Ultra探针（6μm电极间距）。该探针使小鼠视觉皮层神经元检出率提升2倍以上，首次实现了轴突信号与小空间"足迹"波形的区分，并对三类皮质中间神经元（PV/SST/VIP）达到~80%的分类精度，为神经环路功能解析提供了革命性工具。

　　

人脑包含近千亿个神经元，这些细胞通过复杂的连接形成神经网络，掌控着我们的思维、感知和行为。要理解大脑的工作原理，神经科学家需要同时记录大量神经元的活动，并准确识别它们的身份和功能。传统脑电记录技术面临两大挑战：一是电极密度不足，会漏掉许多小尺寸的神经信号；二是难以区分不同细胞类型，特别是各种抑制性神经元。

近年来，高密度硅电极阵列如Neuropixels探针已经能够在单次实验中记录数百到数千个神经元的活动。然而，即使是目前最先进的Neuropixels 2.0探针，其电极间距也有15μm，仍然无法精确捕捉那些空间"足迹"较小的神经信号，包括许多轴突信号和小型神经元的活动。此外，现有的技术在区分大脑中丰富多样的细胞类型方面仍然力不从心。

为了解决这些限制，由Nicholas A. Steinmetz领导的大型国际合作团队开发了新一代超高密度神经记录探针——Neuropixels Ultra（NP Ultra）。这项突破性技术于2025年12月发表在《Neuron》杂志上，为神经科学研究提供了全新的工具和见解。

研究团队采用创新的电极设计和制造工艺，开发了电极间距仅6μm的超高密度探针，比前代产品密度提高了10倍以上。该探针具有5×5μm的氮化钛记录点，排列成768×8的网格，在4.6mm×48μm的区域内密集采样脑组织。探针保持了与前代产品相同的外形因子和机械特性，同时能够从6,144个可用位点中同时记录384个通道。研究人员在小鼠、猴、蜥蜴和电鱼等多种模式生物中进行了验证性实验，通过光遗传学标记、药理学调控和计算建模等方法系统评估了探针性能。

NP Ultra探针最显著的优势是其卓越的空间分辨率。研究人员发现，这种超高密度采样显著提高了信号质量和神经元检出率。在小鼠视觉皮层记录中，神经元产量增加了2倍以上。更重要的是，这种高空间分辨率使研究人员能够观察到前所未有的细节——他们发现细胞外波形的一个特征，即空间范围或"足迹"，能够区分轴突记录和胞体记录。

更高位点密度提高了 spike sorting 的质量和产量

研究团队应用了新的 spike sorting 算法DARTsort，该算法特别适合密集记录。通过估计每个尖峰相对于探针的3D空间位置，研究人员能够推断探针与大脑之间的相对运动，注册尖峰位置并进行聚类，从而在探针运动过程中提供波形形状的准确近似。

与之前的Neuropixels探针相比，NP Ultra记录的尖峰具有更高的峰值波形振幅、更高的信噪比(SNR)和更精确的尖峰位置空间估计。研究人员通过空间重采样他们的NP Ultra记录来模拟在相同位置但不同记录点模式下会记录到的信号，包括NP 1.0样模式、NP 2.0样模式以及假设的"大密度"模式。

NP Ultra原始记录中的峰值尖峰振幅最高。在大型密集模式中观察到的峰值位点振幅减少(差异23%)反映了相对于NP Ultra的较大记录位点的效果，而在1.0样(差异35%)和2.0样(差异33%)位点模式下的振幅减少反映了较大位点跨空间平均的效果，以及由于位点之间的间隙未能对峰值位置进行采样。

NP Ultra较高的尖峰振幅克服了其小位点的较高噪声，当考虑所有通道记录的组合信号时，产生了更高的SNR。NP Ultra记录的神经元具有最大的模板SNR，其次是大型密集、2.0样和1.0样位点模式。NP Ultra增加的点密度还产生了比先前探针显著更高的每个尖峰估计空间位置的精度。

改进的SNR和空间精度增加了可排序神经元的产量。研究人员发现，NP Ultra具有更高的视觉响应神经元产量，平均比1.0样、2.0样和大型密集模式多出10个以上的神经元。NP Ultra与1.0之间的巨大产量差异相当于超过2倍的改进。NP Ultra记录了具有大和小振幅波形的更多神经元。

NP Ultra增加的视觉响应神经元产量转化为视觉刺激解码的更高性能。图像身份解码的准确性对于NP Ultra显著高于大型密集、2.0样和1.0样模式(中位准确性分别增加1.8%、3.8%和3.0%)。NP Ultra解码准确性的增加源于神经元数量的增加，而不是恢复神经元属性的任何差异。

NP Ultra较高的位点密度还提供了适度改进的能力来稳定地跟踪随时间漂移的神经元位置。研究人员发现，NP Ultra、1.0样和2.0样模式之间的稳定性比率存在显著但适度的差异，但NP Ultra与大型密集模式之间没有差异。

小鼠皮层中轴突和树突的亚细胞记录

具有小于20μm的波形衰减距离的神经元或亚细胞结构，如果动作电位在电极接触之间引发，将不会被NP 1.0探针检测到，但在NP Ultra数据集中观察到了这些信号。为了量化这一观察结果，研究人员为每个波形计算了其"空间足迹"，即从峰值通道开始平均尖峰振幅降至30μV以下的半径，这个值足够高于噪声水平。

他们观察到了这个量的双峰分布，其中有相当一部分足迹小于20μm，他们将其定义为具有"小足迹"。这些小足迹波形很可能起源于轴突。为了测试这一点，研究人员将GABA激动剂蝇蕈醇应用于皮层，以抑制体细胞尖峰，同时保留非局部轴突的活动不受影响。所有在蝇蕈醇应用后存活下来的记录波形( firing rate >1 spike/s in muscimol; 23/175, n=6 sessions, n=3 mice)都具有小足迹。

并非所有小足迹波形都在蝇蕈醇应用中存活下来，这与来自本地起源的轴突记录一致。除了它们的小空间足迹外，抗蝇蕈醇的轴突波形在外观上不一致：有些具有狭窄的负峰，几乎没有或没有早期正成分，而其他则具有显着的早期正峰。类似地，组织学定位到胼胝体的尖峰波形可能具有这两种波形特征中的一种或两种。生物物理学模拟证实，小足迹、狭窄的负尖峰可以在Ranvier结处观察到，正峰可能出现在原本有髓轴突的无髓片段中，而无髓轴突由于它们的振幅小，不太可能被检测到，除非它们具有大量的分支和终止。

NP Ultra还以比先前技术更高的分辨率和SNR记录来自神经元的树突区室。皮层锥体神经元顶树突中反向传播动作电位的细胞外记录已用NP 1.0和其他探针报道过。研究人员使用NP Ultra和NP 1.0以及插入策略进行了记录，以获得与小鼠V1中顶树突大致对齐的记录。

首先，他们对第5层锥体神经元进行了光标记(Sim1-Cre;Ai32)，并观察了与已知反向传播波形特征(即，在体细胞尖峰时间处的初始正峰)和速度一致的传播波形。然后，为了在顶树的更大范围内记录树突信号，他们切换到线性192×2配置。使用这种配置，他们记录了跨越超过400μm从推定体细胞通道的反向传播动力学，空间分辨率比NP 1.0高约7倍(6μm线性间距 vs. 40μm)。这种增强的分辨率导致在解析顶树突上的反向传播信号方面显着更高的SNR。这些相对于NP 1.0记录的改进不依赖于探针对齐或记录质量，因为它们在比较类似振幅的树突信号时持续存在。

除了反向传播之外，他们的数据集还揭示了许多具有以前未报道过的独特时空特征的波形，这些波形类似于紧密树突并置的生物物理学模拟。

跨小鼠脑区和不同物种的小足迹细胞外动作电位

为了评估小足迹动作电位在不同脑区和物种中的普遍性，研究人员在鼠标脑的多个脑区内以及多个物种的特定脑区中进行了NP Ultra记录。

他们在清醒头固定小鼠脑的18个脑区中记录了4,666个单单位(>50 single units/region; n=4 mice; n=12 sessions)。NP Ultra在每个脑区记录了许多小足迹波形，具有各种不同的空间特征，反映了其他情况下不可观察或采样不足的单位。

正如在NP 1.0记录中一样，他们观察了单通道尖峰波形特征的广泛分布，如振幅、峰谷比(PTR)和尖峰持续时间，跨脑区。在他们记录的每个脑区中，相当一部分细胞外动作电位(在大多数区域中>10%)的空间足迹小于20μm。与初级视觉皮层(VISp)相比，在胼胝体(57.5%, 31.4±26.1μm, mean±SD, 113 units)和齿状回(DG)(75.3%, 20.0±16.2μm, 77 units)局部化的记录中，小足迹波形的这一比例显著更大。

他们在四个物种中的每一个中都观察到了大量足迹小于20μm的单位，确立了这一观察的普遍性。他们在猴子视觉皮层中发现了13/124个小足迹波形(10.5%)，与小鼠密切匹配(36/359, 10.0%)。小鼠和猴子视觉皮层之间足迹的类似总体分布与在这两个物种的这个区域中体细胞大小的类似分布一致，尽管在其他皮层区域中体细胞大小存在差异。蜥蜴内侧皮层中单位的类似比例具有小足迹(2/19, 10.5%)。接近一半的在电鱼小脑(CB)中检测到的单位具有小足迹(18/37, 48.7%)。

遗传鉴定细胞类型的空间足迹

除了如上所述依赖于亚细胞形态学和脑区外，记录神经元的空间足迹在遗传细胞类型之间也不同。为了测量和比较遗传鉴定细胞的尖峰波形，研究人员在视觉皮层中对三种抑制性神经元类型进行了光标记： parvalbumin-(PV)、somatostatin-(SST)和vasoactive intestinal polypeptide(VIP)表达细胞。

基于无监督的基于密度的聚类方法和定性评估，243个PV、116个SST和126个VIP中间神经元被鉴定为光标记(PV靶向小鼠中243/3,344=7.3%的单位被标记；SST为116/2,641=4.4%；VIP为126/3,492=3.6%)。光标记的神经元具有多样的时空波形。他们计算了每个光标记单位的空间足迹，发现足迹主要是大的，并且在所有三种细胞类型之间显著不同(PV的中位足迹=40.0μm，SST为35.0μm，VIP为42.0μm)。

他们将所有未标记的单位基于尖峰持续时间分为窄尖峰(NS, duration <0.4 ms; n=2,058)和规则尖峰(RS, duration ≥0.4 ms; n=6,838)，并检查了这两组中的足迹分布。令人惊讶的是，他们发现NS波形与RS相比显示出明显的双峰足迹分布。基于这一观察，他们根据足迹将未标记的NS组细分为两类(大于或小于20μm)，他们称之为大NS(NS_L, n=952)和小NS(NS_S, n=1,133)单位。

PV+光标记神经元与NS有重叠的足迹分布，但与NS_S没有。此外，PV+神经元和NS_L单位在使用线性判别分析的多波形特征下不能很好区分(0.56±0.04, mean±SEM)，而PV+神经元和NS_S单位高度可区分。

NS_S单位向推定的下游神经元提供兴奋性或抑制性单突触输入，进一步支持了尽管它们的NS波形，它们起源于极端轴突记录而不是PV+中间神经元的解释。为了调查这一点，他们进行了交叉相关图分析，以识别推定的单突触连接对。这样的对很少见(<0.02% of all observed interactions, >125,000 pair interactions)。他们发现了在短延迟(<3 ms)从NS_S单位的时间推定的兴奋性和抑制性相互作用的实例。

皮层抑制性神经元的分类

NP Ultra的密集和小记录位点获取了关于记录神经元的电学特征的更高分辨率信息，改善了从细胞外特征的细胞类型分类。为了测试这一点，他们采用了解码方法来评估分类性能。他们首先在单个光标记类型(PV、SST或VIP)与未标记单位之间训练了一个逻辑回归模型，使用所有记录的波形特征作为预测因子。

该模型表现良好，特别是与单独使用波形持续时间的模型相比，当使用平衡采样时(PV正确率为89%，SST为82%，VIP为83%)以及当保持中间神经元比例大约等于皮层中发现的比例时。他们使用每个单位的峰值振幅通道提取了单通道波形特征，揭示了上述每种类型神经元独特的波形特征。

降低特征的维度揭示了根据这些特征的细胞类的显著但不完全的分离。因此，他们进行了细胞类型分类的定量评估。

与NP 1.0相比，NP Ultra的密集采样改善了中间神经元分类。为了分析这一点，他们训练了一个非线性监督分类器(随机森林)来预测每个神经元在RS、NS_L、NS_S、PV、SST和VIP类型中的身份，组间平衡(机会性能=0.17)。当训练在三个不同的特征集上时评估模型性能：单通道波形特征(1-ch features)、单通道波形本身或所有1-ch特征与足迹半径(1-ch wf, 1-ch+footprint)。

由于使用所有单位时，使用单通道波形分类器准确性没有比使用单通道特征提高，他们在这里只关注使用单通道特征和足迹的分析。总体而言，在这两个特征集上，这六个类的分类性能显著高于机会水平(mean±SD accuracy: 1-ch feats.=0.63±0.03, 1-ch feats.+footprint=0.67±0.04)。

为了比较NP Ultra波形与较低分辨率的NP 1.0波形，他们对NP Ultra记录的单位数据进行空间重采样，以提供直接的单位对单位比较。NP Ultra记录的单位无论分类中使用的特征如何，都比NP 1.0具有更好的性能(mean accuracy for NP 1.0-like: 1-ch feats.=0.44±0.16, 1-ch feats.+footprint=0.46±0.15)。

NP Ultra相对于NP 1.0样数据的性能改进扩展到使用所有六个单位类别的分类：RS单位以最高准确性分类(mean±SD=0.83±0.10)，其次是NS_S(0.71±0.08)、SST(0.67±0.10)、PV(0.59±0.09)、VIP(0.49±0.09)和NS_L(0.48±0.11)。注意，PV和NS_L之间的错误，代表最大的错误来源， presumably reflect the fact that these two classes are largely overlapping, as discussed above.

当只考虑那些具有真实身份识别的三个单位类时，分类性能甚至更高，并且对于NP Ultra相对于1.0仍然优越。他们只对那些已被光标记的神经元(PV、SST和VIP)进行了分类。为了实现最大准确性，他们使用通过多模态对比学习的神经元嵌入(NEMO)算法进行分类，这是一种基于从波形和自相关图特征的对比学习的方法。仅在这三种类型中的准确性很高，平均为80.33%。

通过进一步分析强化了空间足迹作为用于区分单位类的有用特征的重要性。使用NP Ultra数据但不使用NP 1.0样数据时，当包括足迹作为特征时，平均分类准确性相对于没有足迹的性能显著增加。当包括足迹时，PV、SST、VIP和NS_L的分类改进，并且与NP 1.0样分类相比，改进幅度更大。

接下来，他们迭代地移除每个特征并评估整体性能的差异，这是特征重要性的度量。这样做揭示了移除足迹对分类性能的影响与尖峰持续时间和基线发射率一样大，但小于平均尖峰间间隔(ISI)。即使仅从足迹、平均ISI和基线发射率(FR)解码，分类器准确性仍然高于机会水平。

研究结论与意义

这项研究引入了NP Ultra，这是一种能够以前所未有的位点密度(1.3 sites/μm)记录细胞外神经活动的设备。这些新探针具有小的位点尺寸和间距，导致与NP 1.0探针相比记录跨度有所 trade-off (288μm vs. 3,840μm垂直跨度)，但允许以前所未有的分辨率采样电场的详细空间结构。

通过利用这种改进的空间分辨率进行细胞外数据记录，研究人员证明了细胞外数据质量的显著改进，包括更高的尖峰振幅和改进的SNR，导致功能响应神经元的产量增加。用NP Ultra探针进行的记录捕捉了亚细胞特征——轴突和树突信号——并为动作电位启动和传播的生物物理学提供了新的窗口。

最后，这种密度的记录提供了增强的细胞类型之间的区分能力，特别是在视觉皮层内的中间神经元细胞类型中得到了具体证明。这些设备因此实现了跨多个脑区和物种的高分辨率测量。此外，他们共享的大规模数据集为 spike-sorting 算法开发、电极阵列设计和生物物理学建模提供了有用的资源。

NP Ultra设备可能对多个实验目标是最优的，但在记录跨度与密度方面相对于其他电生理选项有 tradeoffs。NP Ultra探针特别适合，相对于NP 1.0和2.0，用于从薄层或小结构中最大化产量，例如单个皮层层、CA1锥体层，或包括 claustrum 和部分 thalamus、基底节、中脑和后脑的皮层下核。NP Ultra也将有助于树突反向传播、轴突信号和细胞类型特异性编码的研究，当所需的时间分辨率、脑区或物种与基于成像的方法不兼容时。

研究人员使用NP Ultra探针在不同物种的多个脑区中检测到了小足迹波形群体，操作上定义为具有小于20μm的电波形范围(小于NP 1.0探针上接触之间的最小距离)。在鼠标视觉皮层中，他们观察到来自鉴定轴突的记录都表现出小足迹。尽管普遍接受的智慧是轴突尖峰具有早期正峰，他们观察到了一部分缺乏这种正峰的轴突波形，与有髓轴突中Ranvier结的记录模拟一致。

在视觉皮层中，窄动作电位波形(≤0.4 ms)尖峰传统上与推定的PV表达NS抑制性中间神经元相关联，因为只有少数SST、VIP和兴奋性神经元具有NS波形。他们发现来自遗传鉴定的抑制性亚类的大多数光标记神经元表现出大的波形足迹，与它们的体细胞大小与锥体神经元相当一致。

他们的结果表明PV+光标记神经元对应于大足迹NS单位(NS_L)，而NS_S单位代表兴奋性和抑制性神经元的轴突段。NS单位占总单位的一小部分，但比例显著(~10%)，并且几乎占NP 1.0数据中所有NS单位的三分之一。因此，可靠地识别推定的PV+中间神经元需要考虑波形持续时间和足迹，没有这些，大约三分之一那些仅通过波形持续时间识别的单位可能被错误识别。

他们记录神经元的细胞类型分类能力在每个细胞类型内通常很高，并且使用NP Ultra相比1.0探针，细胞类型之间的分类显著改进。然而，他们的发现适用于使用先前探针进行的现有记录，使得能够基于单通道波形以合理的准确性水平将记录的单位识别为PV+、VIP+、SST+或其他。

总之，他们的发现集体突出了具有增加位点密度的电生理探针对于广泛神经科学应用的优势，包括在目标区域最大化产量、灵敏检测小足迹波形和区分细胞类型。