靶向SARS-CoV-2 Delta与Omicron变异株的双价mRNA疫苗ARCoV-Biv的开发与免疫特性研究

本刊推荐：本研究成功开发了一种新型双价mRNA疫苗ARCoV-Biv，其同时靶向SARS-CoV-2 Delta与Omicron BA.1变异株的受体结合域（RBD）。实验证明该疫苗在小鼠模型中可诱导高水平中和抗体（NT50最高达87,556）及强效T细胞免疫，且作为加强针能显著提升对多种Omicron亚型（如BA.2.12.1和BA.4/5）的交叉中和能力，为应对新冠病毒变异提供了具有广谱保护潜力的疫苗策略。

　　

引言

COVID-19大流行由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起，已导致全球性的公共卫生危机。疫苗接种被视为控制病毒传播最有效的策略，然而病毒持续变异对现有疫苗的保护效果提出了严峻挑战。尤其是Delta和Omicron变异株，因其显著增强的传播能力和免疫逃逸特性，成为全球疫情反弹的主要推手。Omicron BA.1变异株携带大量突变，可能逃避由疫苗或既往感染所诱导的免疫力。随着病毒不断进化，诸如XBB.1.5、BA.2.86和JN.1等新亚型的出现，进一步凸显了更新疫苗抗原以维持防护效果的紧迫性。

mRNA疫苗技术凭借其开发周期短、生产成本低以及快速应对病毒变异的能力，在此次 pandemic 中展现出巨大潜力。 Moderna和Pfizer/BioNTech开发的mRNA疫苗是最早获批用于人体的新冠疫苗之一。与传统的灭活全病毒疫苗或腺病毒载体疫苗相比，mRNA疫苗通过将编码抗原的核苷酸序列递送至体内，进而激发保护性免疫应答，在多国的大规模接种中显示出较高的效能。

尽管单价疫苗对原始毒株具有良好的保护效果，但其对变异株、特别是Omicron的中和活性显著降低。为拓宽防护范围，双价疫苗应运而生，它们同时包含两种不同毒株的抗原成分。然而，抗原原罪（Original Antigenic Sin, OAS）现象可能影响免疫系统对新变异株的反应强度，即先前的抗原暴露可能使免疫应答偏向于原始毒株，从而削弱对新兴变异株的有效反应。 Moderna的mRNA-1273.214是一款靶向原始毒株和Omicron BA.1的双价疫苗，临床试验显示其针对BA.1的中和活性有所改善，但对BA.5和XBB等后续亚型的防护效果仍显不足，且保护效力随时间推移而衰退。

材料与方法

伦理声明

所有动物实验均严格遵循中国《实验动物管理条例》及《实验动物环境及设施要求》的指导原则进行，并经由军事医学科学院实验动物中心动物实验伦理委员会批准（批准号：IACUC-IME-2019–014）。

细胞系

人肝癌细胞Huh7在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37°C条件下培养。细胞密度达80%时，按1:2或1:3的比例传代，每2–3天一次。该细胞系用于mRNA转染、蛋白表达验证（免疫印迹和免疫荧光）以及假病毒中和试验。

SARS-CoV-2 Delta与Omicron RBD的序列选择

Delta变异株（GISAID ID: EPI_ISL_1999775，2021年印度分离）和Omicron BA.1（EPI_ISL_6752027，2021年南非分离）的RBD序列被选用于mRNA设计。选择依据是其在疫苗设计时的流行程度以及显著的免疫逃逸特性。

质粒构建与mRNA生产

将Delta和Omicron BA.1 RBD的密码子优化DNA序列克隆至ABOP-028载体中。利用T7 RNA polymerase介导的体外转录（IVT）反应合成mRNA，其两侧包含5′和3′非翻译区（UTRs）以及多聚腺苷酸尾（polyA tail），以增强mRNA的稳定性和翻译效率。

mRNA合成与质量控制

通过IVT反应合成mRNA，并用脂质纳米颗粒（LNP）进行包封。采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳（Fragment Analyzer）分析mRNA完整性，紫外分光光度法（A260/A280比值>2.0）确认RNA纯度，qPCR定量残留DNA污染，并确保内毒素水平低于0.5 EU/μg RNA。

免疫印迹

将Huh7细胞以3×10⁵细胞/孔的密度接种于12孔板中，转染3 μg/孔的Delta或Omicron BA.1 RBD mRNA。转染24小时后收集上清，通过SDS-PAGE和PVDF膜转移，使用SARS-CoV-2 Spike抗体检测RBD蛋白表达。

免疫荧光测定

在Huh7细胞中转染3 μg/孔的RBD mRNA，24小时后固定细胞，使用Omicron BA.1 Spike蛋白一抗（1:500）和Alexa Fluor 488标记的二抗（1:200）进行染色，DAPI复染核，荧光显微镜下观察。

mRNA的脂质纳米颗粒包封

参照ARCoV的制备方法，将mRNA与脂质溶液（包含可离子化脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质，摩尔比48:10:40.5:1.5）在T型混合器中混合，经切向流过滤（TFF）系统过滤并浓缩，最终制剂保存于2–8°C。双价疫苗ARCoV-Biv由编码Delta和Omicron变异株的mRNA按1:1比例混合后包封于LNP中制成，同时制备了单价疫苗ARCoV-Delta、ARCoV-Omicron以及空LNP安慰剂对照。

动态光散射

使用Malvern Zetasizer Nano-ZS测定LNP制剂的水合动力学直径和多分散指数（PDI）。

稳定性测试

将ARCoV-Biv与单价疫苗置于不同温度（4°C、25°C、37°C）下储存约1个月，定期检测粒径和PDI的变化。

小鼠免疫

6–8周龄雌性BALB/c小鼠以2 μg/剂的剂量肌肉注射接种ARCoV-Biv、ARCoV-Delta、ARCoV-Omicron或安慰剂，14天后加强免疫一次。于免疫后28天收集血清用于免疫原性分析，第21天取脾细胞通过ELISpot检测细胞免疫反应。每组样本量n=10，基于先前SARS-CoV-2 mRNA疫苗研究中的统计效能分析确定。

ARCoV-Biv加强效果测试

小鼠先接种两剂ARCoV疫苗（1 μg/剂），于初次免疫后第91天给予一剂ARCoV-Biv加强针（2 μg/剂），分别在第90天和第105天采集血清进行分析。

酶联免疫吸附试验

将SARS-CoV-2原型株、Delta和Omicron BA.1的RBD抗原包被于96孔板，血清样本从1:2000开始梯度稀释，使用HRP标记的羊抗鼠IgG二抗和TMB底物显色，读取450 nm吸光度。

假病毒中和试验

采用基于水泡性口炎病毒（VSV）的荧光素酶报告假病毒系统。将血清样本3倍梯度稀释（起始1:300），与假病毒共孵育后加入Huh7细胞，24小时后检测荧光素酶活性，计算半数中和滴度（NT₅₀）。

酶联免疫斑点（ELISpot）测定

取免疫后21天的小鼠脾细胞，分别用Delta和Omicron BA.1 RBD肽库刺激，使用IFN-γ和IL-2 ELISpot试剂盒检测斑点形成细胞（SFCs）数量。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。数据以均值±标准误（SEM）表示，符合正态分布和方差齐性时采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验，否则使用Kruskal-Wallis检验及Dunn多重比较（Bonferroni校正）。P值小于0.05视为具有统计学显著性。

效能分析

通过G*Power 3.1软件进行先验效能分析，设定效应量f=0.58、α=0.05、统计效能1?β=0.80，确定每组至少需要10只小鼠才能检测出组间差异。

结果

变异株mRNA疫苗的构建与稳定性分析

成功开发了靶向Delta和Omicron BA.1变异株的mRNA疫苗ARCoV-Delta和ARCoV-Omicron，并在此基础上构建了双价疫苗ARCoV-Biv。免疫印迹和免疫荧光结果证实，转染后的Huh7细胞可有效表达RBD蛋白。动态光散射显示，ARCoV-Biv的平均粒径为71.7 nm，PDI为0.016，表明其具有优异的物理化学特性。在不同温度下储存1个月后，ARCoV-Biv及单价疫苗的粒径和PDI均保持稳定，PDI始终低于0.2，与ARCoV相当，证明其具备良好的贮藏稳定性。

双价与单价疫苗的免疫原性评估

接种两剂疫苗后，ELISA检测显示ARCoV-Biv诱导了最高水平的RBD特异性IgG抗体滴度，针对原型株、Delta和BA.1的均值分别为175475.2、128399.3和136606.2，较ARCoV-Delta提高22%–32%，较ARCoV-Omicron提升最高达4.6倍。假病毒中和试验进一步揭示，ARCoV-Biv对各变异株均能诱发广泛的中和抗体反应，NT₅₀值分别为：原型株9485.4、Delta 16059.4、Beta 3147.2、BA.1 8368.4、BA.2 3486.6、BA.4/5 510.4。相比之下，ARCoV-Omicron仅对Omicron变异株表现出高中和活性，而对非Omicron变异株的中和能力微弱（如原型株仅89.2）。ELISpot结果显示，ARCoV-Biv还能激发强烈的T细胞应答：针对Delta和Omicron RBD肽库刺激，IFN-γ分泌细胞分别为1641.7和1589.0 SFC/10⁶脾细胞，IL-2分泌细胞为996.8和743.4 SFC/10⁶脾细胞，显著高于单价疫苗组和PBS对照组。

ARCoV-Biv加强针对抗SARS-CoV-2变异株的抗体应答提升效果

在预先接种两剂ARCoV的小鼠中，加强免疫前血清对原型株和Delta的中和抗体滴度较高（分别为2756.67和1229.93），但对Omicron亚株较低（BA.1为131.68，BA.2.12.1和BA.4/5均为30左右）。经ARCoV-Biv加强后，各项中和滴度均显著上升：原型株11468.33（提高41.6倍）、Delta 87556.33（71.19倍）、BA.1 52634.67（399.72倍）、BA.2.12.1 5700.67（190.02倍）、BA.4/5 1289.50（42.98倍）。这表明ARCoV-Biv作为加强针，能极大增强对多种Omicron亚型的交叉中和能力。

讨论

本研究开发的双价mRNA疫苗ARCoV-Biv，同时靶向Delta和Omicron BA.1变异株的RBD区域。与Moderna的mRNA-1273.214等包含原始毒株抗原的双价疫苗相比，ARCoV-Biv采用了一种不包含原始毒株的创新设计，旨在避免抗原原罪可能造成的免疫偏向，从而更有效地激发针对新变异株的广谱中和抗体。选择RBD作为抗原靶点，既能集中诱导中和抗体，又可减少对无关表位的应答，降低抗体依赖增强（ADE）的潜在风险。

在实验体系中，即便在较低剂量下，ARCoV-Biv也表现出与甚至优于其他疫苗平台的中和效能。尤其值得注意的是，它不仅引发高水平的中和抗体，还诱导了强烈的Th1偏向型细胞免疫反应，这通过ELISpot检测到的IFN-γ和IL-2分泌得以证实。这类细胞应答对于控制病毒复制、预防重症至关重要。此外，加强免疫实验结果显示，ARCoV-Biv能显著提升对Omicron亚型（如BA.2.12.1和BA.4/5）的中和活性，其增强幅度超越已报道的蛋白亚单位疫苗加强效果。

然而，本研究的免疫持久性仅观察至105天，其长期保护效果尚不明确。已有研究提示，包括辉瑞BA.4/5加强针和Moderna mRNA-1273.222在内的双价疫苗，其效力在接种后4–6个月显著减弱，特别是对XBB等变异株。因此，未来需对ARCoV-Biv诱导的免疫记忆反应进行长期追踪，并在人体临床试验中验证其真实世界的保护效力和持久性。此外，本研究未开展活病毒攻击实验，无法直接证实该疫苗对感染和重症的防护效果。尽管中和抗体滴度与保护作用相关，但仍需在动物模型中通过活毒挑战进一步评估其对抗XBB.1.5、BA.2.86等高免疫逃逸变异株的实际效能。

所有数据均来自小鼠模型，物种差异可能影响疫苗在人体中的代谢、抗原提呈和免疫记忆形成等特点。因此，推进临床试验至关重要，应重点评估ARCoV-Biv在人体中的安全性、免疫原性以及对现实感染的保护效果。随着Omicron新亚型的不断涌现，本研究所采用的抗原设计策略——避开原始毒株、直接靶向流行变异株——为下一代新冠疫苗的开发提供了重要参考。ARCoV-Biv的模块化结构使其能快速适配未来可能出现的新变异株，具备作为可扩展疫苗平台的潜力。

总结而言，ARCoV-Biv是一款具有广谱保护潜力的候选疫苗，其作为加强针能高效提升对多种SARS-CoV-2变异株的免疫应答。持续抗原更新及跨株防护效能评估将是未来疫苗研发的重点，而ARCoV-Biv的设计策略为应对病毒进化提供了有力工具。