锌通过激活ERK1/2介导的自噬缓解血管钙化

《Scientific Reports》：Zinc alleviates vascular calcification by activating ERK1/2-mediated autophagy

慢性肾脏病(CKD)常并发矿物质与骨异常(CKD-MBD)及血管钙化(VC)，是心血管事件高发的重要原因。本研究探讨了微量元素锌对CKD-MBD及VC的影响及其机制。研究发现，在CKD模型大鼠和β-甘油磷酸(β-GP)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型中，锌补充能改善血尿生化指标、纠正骨代谢异常、减轻主动脉钙化，并通过激活细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路上调自噬水平，从而发挥保护作用。该研究为利用锌干预CKD相关VC提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。

　　

心血管疾病是慢性肾脏病（CKD）患者死亡的主要原因，而血管钙化（VC），特别是中膜钙化，是其中的关键风险因素。在CKD患者中，矿物质与骨异常（CKD-MBD）非常普遍，它涵盖了生物化学标志物异常、骨代谢紊乱以及血管钙化。面对这一严峻的健康挑战，探寻有效的干预策略至关重要。锌作为一种必需的微量元素，在细胞代谢中扮演重要角色。值得注意的是，CKD患者血清锌水平常常偏低，且与心血管疾病风险相关。近年来的研究提示锌可能对血管钙化具有保护作用，但其在CKD背景下具体的作用机制，尤其是是否通过影响细胞自噬这一重要的细胞自我清理过程来发挥作用，尚不明确。

为了回答这些问题，来自中国医科大学附属第一医院的研究团队在《Scientific Reports》上发表了题为“Zinc alleviates vascular calcification by activating ERK1/2-mediated autophagy”的研究论文。该研究旨在评估锌对CKD大鼠模型中CKD-MBD和自噬的影响，并深入探索锌在高磷环境下对血管平滑肌细胞（VSMC）钙化和自噬的作用机制。

研究人员综合运用了体内动物实验和体外细胞模型。他们采用富含0.25%腺嘌呤且低维生素K的饮食喂养Wistar雄性大鼠，成功构建了CKD模型，并通过灌胃方式补充氯化锌（ZnCl₂）。在细胞层面，他们使用10 mM的β-甘油磷酸（β-GP）诱导A7R5血管平滑肌细胞发生钙化。关键技术方法包括：通过阿尔新红染色和钙含量测定评估钙化程度；利用蛋白质印迹（Western Blot）和免疫组织化学/免疫荧光技术检测相关蛋白（如α-SMA、Runx2、LC3、Beclin1、磷酸化ERK1/2等）的表达；采用透射电子显微镜（TEM）观察自噬体的形成；并使用微型电子计算机断层扫描（Micro-CT）分析大鼠股骨的骨微结构变化。此外，研究还使用了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和ERK1/2通路抑制剂U0126进行干预，以验证锌的作用通路。

锌对CKD大鼠体重、血液生化及尿液生化的影响

研究结果显示，与对照组（CTR）相比，CKD模型组大鼠体重下降，血清肌酐（SCr）、血磷（SP）、尿钙（UCa）、甲状旁腺激素（PTH）、核因子κB受体活化因子配体（sRANKL）、I型前胶原氨基端前肽（PINP）和I型胶原交联C-末端肽（CTX-I）水平显著升高，而血钙（SCa）水平降低。补充锌后，CKD大鼠的SCa水平升高，SCr、SP、UCa、PTH、sRANKL、PINP和CTX-I水平则明显降低，但对大鼠体重和尿磷（UP）水平无显著影响。各组间血清锌（SZn）水平无显著差异。这表明锌补充改善了CKD大鼠的肾功能和矿物质代谢紊乱，并有助于调节骨转换标志物。

锌对CKD大鼠主动脉钙化和自噬的影响

通过阿尔新红S染色和钙含量定量分析发现，CKD组大鼠主动脉出现明显的橙红色钙沉积，而补充锌后（CKD+Zn组），钙沉积显著减少。蛋白质印迹和免疫组织化学分析表明，CKD组血管平滑肌细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达下降，成骨关键转录因子Runt相关转录因子2（Runx2）表达升高，同时自噬相关蛋白Beclin1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）-II/I的比值也升高。补充锌进一步提高了α-SMA、Beclin1和LC3-II/I的表达，同时降低了Runx2的表达。这说明在CKD状态下，锌能够减轻血管钙化，并进一步激活血管组织的自噬水平。

锌对CKD大鼠骨代谢的影响

通过Micro-CT对大鼠股骨远端进行分析发现，与对照组相比，CKD组大鼠的骨体积分数（BV/TV）、骨表面积分数（BS/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁骨密度（Tb.BMD）、总皮质骨面积（Tt.Ar）、皮质骨面积（Ct.Ar）、皮质骨面积分数（Ct.Ar/Tt.Ar）和皮质骨厚度（Ct.Th）均降低，而骨小梁分离度（Tb.Sp）和皮质骨孔隙率（Ct.Po）增加。补充锌后，这些骨微结构参数得到显著改善，BV/TV、BS/TV、Tb.N、Tb.BMD、Tt.Ar、Ct.Ar和Ct.Ar/Tt.Ar升高，Tb.Sp和Ct.Po降低。这表明锌补充能够改善CKD导致的骨代谢异常和骨质量下降。

锌对β-GP诱导的VSMC钙化的影响

在细胞实验中，研究人员首先确定了锌的安全作用浓度（10-40 μM）。钙含量测定和阿尔新红S染色结果显示，β-GP诱导的VSMC钙化结节形成和钙含量显著增加，而不同浓度的锌（特别是30 μM）处理能有效抑制这一过程。蛋白质印迹分析证实，锌处理上调了VSMC标志物α-SMA的表达，下调了成骨标志物Runx2的表达。这表明锌能直接抑制高磷环境诱导的VSMC钙化。

锌对β-GP诱导的VSMC自噬的影响

为了探究锌是否影响自噬，研究人员检测了自噬相关蛋白的表达。结果显示，与对照组相比，β-GP处理增加了LC3-II/I和Beclin1的蛋白表达。更重要的是，在β-GP存在下加锌处理（β-GP+Zn组）进一步升高了这些自噬蛋白的水平。免疫荧光染色显示，锌处理增加了LC3斑点的形成。透射电镜观察也发现，β-GP+Zn组细胞内的自噬体数量多于β-GP组。这些结果共同表明，高磷环境可诱导VSMC自噬，而锌能进一步增强这种自噬反应。

锌通过增强自噬来减轻β-GP诱导的VSMC钙化

为了验证锌是否通过促进自噬来抑制钙化，研究人员使用了自噬抑制剂3-MA。结果显示，预先用3-MA处理VSMC，能够逆转锌对β-GP诱导的钙化的保护作用，表现为钙沉积增加，Runx2表达回升，而α-SMA、LC3-II/I和Beclin1的表达下降。同时，免疫荧光下的LC3斑点和电镜下的自噬体数量也减少。这明确表明，锌是通过促进自噬来发挥其抗VSMC钙化作用的。

锌通过激活ERK1/2信号通路增强自噬

已有研究表明ERK1/2通路可能参与锌调控的自噬。本研究中，蛋白质印迹显示，锌处理提高了β-GP诱导的VSMC中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的水平。当使用ERK1/2通路抑制剂U0126预处理细胞后，锌引起的自噬增强效应（表现为LC3-II/I和Beclin1表达上调）被抑制，同时锌的抗钙化作用也被削弱（钙沉积增加，Runx2表达回升，α-SMA表达下降）。这表明锌是通过激活ERK1/2信号通路来上调自噬水平，进而缓解VSMC钙化的。

综上所述，本研究得出结论：补充锌能够改善CKD大鼠的CKD-MBD表现，包括抑制血管钙化和改善骨代谢紊乱。其机制在于，锌激活了VSMC中的ERK1/2信号通路，进而增强自噬活性，最终对抗高磷环境诱导的钙化。这项研究不仅揭示了锌在CKD并发症中的保护作用新机制——即通过ERK1/2-自噬轴发挥作用，也为开发以锌或调控该通路为靶点的治疗策略，以降低CKD患者心血管疾病风险提供了重要的实验依据和新的思路。未来研究可进一步在更复杂的体内模型中验证这一机制，并探索锌补充在CKD患者临床干预中的潜在价值。