原位生物合成非经典氨基酸：人工酶的设计与进化及其在不对称Friedel-Crafts烷基化反应中的应用

《Nature Communications》：Design and evolution of artificial enzyme with in-situ biosynthesized non-canonical amino acid

本研究针对非经典氨基酸（ncAAs）外源添加成本高、膜通透性差等瓶颈，开发了一种将ncAAs原位生物合成与遗传编码整合的策略。研究人员成功构建了含巯基苯胺（pAPhC）残基的人工酶SFC_pAPhC，并证实其可高效催化对映选择性Friedel-Crafts烷基化反应。经定向进化后，该酶展现出优异的对映选择性（高达95% e.e.）和反应活性（高达98%产率），为构建具有异源催化功能的人工酶提供了通用平台。

　　

在化学合成领域，酶因其高效、高选择性和环境友好的特性而备受青睐。然而，天然酶主要催化生命体内的化学反应，对于许多非天然（abiological）的转化过程，如构建复杂手性分子的关键反应，往往无能为力。为了突破这一局限，科学家们致力于设计“人工酶”（designer enzymes），即通过改造蛋白质骨架，引入非天然的催化基团，从而赋予其全新的催化功能。

其中，遗传密码子扩展（genetic code expansion）技术是一项革命性的工具。它允许科学家在蛋白质的特定位点精确引入非经典氨基酸（non-canonical amino acids, ncAAs）。这些ncAAs可以携带天然氨基酸所不具备的化学基团，为构建人工酶提供了丰富的“零件库”。然而，这一领域的发展却面临着一个巨大的瓶颈：大多数具有潜在催化活性的ncAAs价格昂贵、合成困难，且难以穿过细胞膜进入细胞内。这导致研究人员通常只能在体外将ncAAs添加到细胞培养基中，不仅成本高昂，而且效率低下，严重限制了人工酶的规模化制备和定向进化。

为了解决这一难题，江南大学周智团队与天津工业生物技术研究所盛翔团队合作，在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表了一项突破性研究。他们提出了一种全新的策略：将ncAAs的生物合成与遗传编码整合到一个“细胞工厂”中，实现ncAAs的原位（in situ）合成与利用。基于这一策略，他们成功设计并进化出一种新型人工酶，该酶含有一个非天然的巯基苯胺（pAPhC）催化残基，能够高效催化对映选择性Friedel-Crafts烷基化反应，并表现出优异的对映选择性和反应活性。

关键技术方法

本研究主要整合了以下关键技术方法：

1. 1.
   非经典氨基酸（ncAAs）原位生物合成系统：利用工程化改造的CysM-NtSat4酶系，以廉价的芳香硫醇（如4-巯基苯胺）为前体，在宿主大肠杆菌（E. coli）细胞内直接生物合成S-芳基半胱氨酸类ncAAs。
2. 2.
   遗传密码子扩展（GCE）系统：利用正交翻译系统（OTS），特别是工程化的Methanococcus jannaschii酪氨酰-tRNA合成酶/酪氨酰-tRNA对（Mj tRNA^Tyr/TyrRS），将原位合成的ncAAs定点、高效地掺入到目标蛋白中。
3. 3.
   蛋白质骨架工程：选用LmrR（Lactococcal multidrug resistance regulatory）蛋白作为人工酶的骨架，该蛋白具有一个大的疏水空腔，易于改造和进化。
4. 4.
   定向进化：通过定点饱和突变和迭代筛选，对人工酶进行多轮进化，以提升其催化活性和对映选择性。
5. 5.
   分子动力学（MD）模拟：利用计算模拟方法，从分子层面揭示人工酶催化反应的对映选择性机制，并指导实验设计。

研究结果

系统构建与优化

研究人员首先构建了一个集成的“细胞工厂”系统。该系统包含三个质粒，分别编码ncAAs生物合成酶系、正交翻译系统以及目标蛋白LmrR的变体（在15位引入琥珀密码子TAG）。通过向该工程菌株中添加廉价的4-巯基苯胺，细胞能够原位合成目标ncAA——S-(4-氨基苯基)-L-半胱氨酸（pAPhC），并将其高效地掺入到LmrR蛋白的15位点，从而成功构建了人工酶SFC_V15pAPhC。与直接外源添加pAPhC相比，原位生物合成策略的蛋白表达量更高，证明了该策略在效率和成本上的优势。高分辨质谱和晶体结构（PDB: 8YRF）均证实了pAPhC的成功掺入。

人工酶催化性能评估

研究人员测试了SFC_V15pAPhC在催化吲哚与α,β-不饱和醛的不对称Friedel-Crafts烷基化反应中的性能。初步测试结果显示，该人工酶具有显著的催化活性，能以74%的对映体过量值（e.e.）和39%的产率生成产物。有趣的是，该酶表现出与先前报道的含对叠氮苯丙氨酸（pAF）残基的人工酶LmrR_V15pAF相反的对映选择性，生成了R构型的产物。这一结果表明，在苯胺的苯环对位引入硫原子，能够显著改变催化残基的电子性质和空间构型，从而影响反应的对映选择性。

定向进化提升性能

为了进一步提升人工酶的催化性能，研究人员对SFC_V15pAPhC进行了多轮定向进化。通过丙氨酸扫描和定点饱和突变，他们筛选出了多个有益突变。经过四轮进化，最终获得了最优突变体SFC4.0（SFC_V15pAPhC_F93I_M8R_A92D）。该突变体在催化上述Friedel-Crafts反应时，表现出卓越的性能，对映选择性高达95% e.e.，产率高达98%。即使在低至1.0 mol%的酶载量下，反应仍能保持优异的对映选择性和活性。动力学分析表明，进化后的SFC4.0的催化效率（k_cat/K_M）比初始的SFC1.0提高了5.5倍。

底物谱考察与级联反应

研究人员考察了SFC4.0的底物普适性。结果表明，该人工酶能够耐受多种取代的烯醛和吲哚底物，以良好的产率和对映选择性生成相应的手性产物。此外，研究还成功实现了克级规模的放大反应，并展示了该人工酶与天然转氨酶（transaminase）的级联反应，用于合成非天然的手性吲哚乙胺，证明了其在复杂生物合成路径中的应用潜力。

对映选择性机制的计算研究

为了阐明SFC_V15pAPhC与LmrR_V15pAF对映选择性相反的分子机制，研究人员进行了分子动力学（MD）模拟。模拟结果表明，在LmrR_V15pAF中，关键的亚胺中间体与D100残基形成氢键，导致2-甲基吲哚倾向于攻击亚胺的Re面，生成S构型产物。而在SFC_V15pAPhC中，亚胺中间体与N88残基形成氢键，使得2-甲基吲哚更稳定地结合在Si面，从而生成R构型产物。对于进化后的突变体SFC4.0，模拟显示其A92D突变引入了新的氢键相互作用，扩大了Si面的结合口袋，从而进一步提高了对映选择性。这些计算结果与实验观察到的对映选择性趋势完全一致。

结论与讨论

本研究成功开发了一种将非经典氨基酸（ncAAs）原位生物合成与遗传编码整合的策略，用于构建具有异源催化功能的人工酶。通过这一策略，研究人员高效地构建了含巯基苯胺（pAPhC）残基的人工酶SFC_pAPhC，并证实其可高效催化对映选择性Friedel-Crafts烷基化反应。经过定向进化，该酶展现出优异的对映选择性（高达95% e.e.）和反应活性（高达98%产率）。计算研究揭示了该酶对映选择性的分子机制，并指导了后续的进化过程。

这项研究的意义重大。首先，它提供了一种通用、高效且经济的策略，用于设计具有非天然催化功能的人工酶。通过利用廉价的硫醇前体在细胞内原位合成ncAAs，该策略克服了外源添加ncAAs的成本和膜通透性限制，为人工酶的规模化制备和定向进化铺平了道路。其次，该研究不仅展示了一个高效的人工酶催化剂，更重要的是，它建立了一个平台，可以轻松地通过更换不同的硫醇前体，构建出具有多样化催化残基的人工酶库，极大地扩展了生物催化剂的工具箱。最后，该研究通过计算模拟与实验验证相结合，深入揭示了人工酶催化反应的机理，为理性设计更高效的人工酶提供了理论指导。