钙调蛋白结合介导TRPA1通道钙依赖性快速脱敏的分子机制

本研究发现TRPA1离子通道的远端C端存在一个进化保守的高亲和力钙调蛋白(Ca2+/CaM)结合元件(DCTCaMBE)，该位点特异性结合CaM的C叶，是介导钙依赖性快速脱敏的关键调控元件。研究人员通过生物化学、生物物理、功能实验等多学科方法证实，破坏该结合位点会导致通道过度活跃和脱敏延迟，揭示了Ca2+/CaM作为TRPA1辅助亚基的重要调控作用，为疼痛和炎症疾病的靶向治疗提供了新思路。

　　

TRPA1（Transient Receptor Potential Ankyrin 1）作为重要的钙离子（Ca²⁺）通透性离子通道，在伤害性感受和炎症过程中扮演关键角色。该通道表现出复杂且机制不明的Ca²⁺调控特性：初始阶段Ca²⁺流入会增强通道活性（强化作用），但随着胞质Ca²⁺浓度升高，通道又会迅速失活（脱敏作用）。这种独特的调控机制对于限制TRPA1的功能窗口至关重要，但其分子基础长期以来难以捉摸。尤其令人困惑的是，TRPA1的电泳激动剂修饰可持续10分钟以上，而通道脱敏却发生在毫秒级时间尺度上，表明Ca²⁺调控是限制TRPA1功能窗口的关键环节。

以往研究表明，TRPA1的强化和脱敏可能是相互独立的调控事件，可能涉及不同的通道机制。虽然已有研究提出TRPA1胞内和跨膜结构域中存在直接Ca²⁺结合位点，但这些位点如何影响Ca²⁺调控以及这些位点本身的存在仍存在争议。更重要的是，这些元素大多位于TRPA1关键结构域中，基因扰动可能会损害通道的固有结构或功能，使得对其Ca²⁺调控效应的解读变得复杂。

离子通道还可被通用Ca²⁺传感器钙调蛋白（Calmodulin, CaM）调控。近期研究表明CaM以Ca²⁺依赖性方式结合TRPA1并影响其Ca²⁺调控，这些效应部分通过TRP螺旋附近的一个CaM结合结构域（CaMBD）介导。然而，对该结构域的遗传扰动仅对TRPA1的Ca²⁺调控产生 modest 影响，可能是由于CaM结合的不完全缺失，这引出了一个有趣的可能性：TRPA1可能含有另一个CaM结合位点。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Justin H. Sanders等人发现了一个先前未报道的、高度保守的、高亲和力的CaM结合元件，位于TRPA1远端未解析结构的胞质C末端（DCTCaMBE）。研究人员通过多学科方法相结合，包括生物化学、生物物理学、建模、NMR光谱和功能实验，揭示了这一关键调控元件的作用机制。

研究人员采用的主要技术方法包括：CaM-agarose pulldown结合实验、比率钙成像（ratiometric Ca²⁺ imaging）、表面生物素化（surface biotinylation）、非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳（TEVC）记录、免疫荧光共定位分析、邻近生物素化（proximity biotinylation） assay、尺寸排阻色谱（SEC）、等温滴定量热法（ITC）和核磁共振（NMR）光谱分析。实验使用了HEK293T细胞系和Neuro2A细胞系，以及非洲爪蟾卵母细胞表达系统。

研究首先发现Ca²⁺/CaM通过其C叶调控TRPA1。CaM-agarose实验显示，人TRPA1（hTRPA1）在基础Ca²⁺浓度（100 nM）下与CaM结合最好，而在较高Ca²⁺浓度下结合逐步减少。功能实验表明，与功能缺陷型CaM1234相比，共表达WT CaM显著抑制了hTRPA1活性，且这种抑制主要由CaM的C叶介导。

通过系统性的截短突变研究，研究人员将CaM结合位点定位到TRPA1远端C末端的最后41个氨基酸内。最小的截短突变（缺失最后11个氨基酸，hTRPA1^Δ1109-1119）即完全消除了CaM结合能力，表明DCTCaMBE位于C末端的极端末端。

失去Ca²⁺/CaM结合导致TRPA1通道过度活跃。hTRPA1^Δ1109-1119突变体表现出显著增加的基底和激动剂 evoked 活性，且这种过度活跃不受WT CaM或CaM1234共表达的影响，表明其Ca²⁺/CaM结合能力确实缺失。

电生理记录显示，缺失CaM结合显著延迟了TRPA1的脱敏动力学。在1.8 mM细胞外Ca²⁺条件下，WT hTRPA1在Ca²⁺加入后25秒内几乎完全脱敏，而hTRPA1^Δ1109-1119突变体在5分钟后仍保持20-30%的初始活性，脱敏速率减慢10-16倍。

细胞共定位和邻近生物素化实验证实，TRPA1和CaM在静息细胞中形成稳定复合物。免疫荧光显示WT hTRPA1与WT CaM在静息神经细胞中显著共定位，而hTRPA1^Δ1109-1119突变体的共定位程度显著降低。邻近生物素化实验进一步证明了WT hTRPA1与CaM C叶在细胞内的直接相互作用。

通过生物物理手段定量分析了TRPA1 DCTCaMBE与Ca²⁺/CaM的相互作用。尺寸排阻色谱表明hTRPA1^1089-1119肽段与WT CaM、CaM12和CaM C叶在Ca²⁺存在下形成稳定复合物。等温滴定量热法测量显示该肽段与CaM12的亲和力（~100 nM）高于与WT CaM的亲和力（~613 nM），表明完全Ca²⁺加载的CaM构象变化减弱了结合亲和力。

同源建模和点突变分析确定了DCTCaMBE的关键残基。基于TRPV1 C端CaM结合段的结构，研究人员建立了TRPA1 DCTCaMBE与Ca²⁺/CaM复合物的同源模型，预测W1103作为疏水锚点与CaM C叶的疏水口袋相互作用。点突变实验证实W1103A、V1110A和多重突变完全消除了CaM结合，且这些残基在脊椎动物TRPA1中高度保守。

W1103A点突变体的功能分析进一步证实了CaM结合对脱敏的关键作用。与截短突变体类似，W1103A突变体表现出正常的强化动力学但显著延迟的脱敏动力学（15-20倍减慢），导致持续的通道活性和显著增加的电荷转运。

最后，研究发现高细胞外Ca²⁺可部分挽救突变体的脱敏缺陷。将细胞外Ca²⁺浓度从1.8 mM增加到10 mM，W1103A突变体的脱敏速率加快了约3倍，但仍比WT通道慢4倍，表明增加Ca²⁺内流只能部分补偿CaM结合的缺失。

研究结论与讨论部分强调，这项工作发现了TRPA1远端C末端中的一个高度保守的、高亲和力的Ca²⁺/CaM结合元件（DCTCaMBE），该元件特异性结合CaM的C叶，是介导Ca²⁺依赖性快速脱敏的关键调控元件。研究人员提出了一个模型，其中Ca²⁺/CaM作为长程变构调节剂，预置一个固有的TRPA1 Ca²⁺结合位点，该位点是真正的脱敏门控。这种方式下，Ca²⁺/CaM作为TRPA1的调控结合伴侣，类似于电压门控离子通道的辅助亚基，用于建立细胞中适当的TRPA1功能窗口。

该研究的重要意义在于：首先，它解决了一个长期存在的争议，明确了CaM在TRPA1 Ca²⁺调控中的核心作用；其次，发现了一个位于结构未解析区域的关键调控元件，强调了这些域在离子通道功能中的重要性；第三，揭示了TRPA1与CaM之间独特的结合模式，即仅通过CaM的C叶进行结合，这不同于大多数CaM调控的离子通道；最后，这些发现为针对TRPA1相关疼痛和炎症疾病的药物开发提供了新的靶点和思路。

值得注意的是，TRPA1 DCTCaMBE位于远端C末端，距离离子传导孔道较远，这提出了一个机制性问题：Ca²⁺/CaM结合如何促进通道脱敏？一个有趣的模型是TRPA1 DCTCaMBE与先前确定的CaMBD（位于离子传导路径附近）之间通过CaM的C叶和N叶顺序结合进行协调响应，随着细胞内Ca²⁺升高而触发脱敏。这种涉及同一通道内不同结合元素的机制在其他CaM调控的离子通道中已有提出。

总之，这项研究不仅揭示了TRPA1 Ca²⁺依赖性脱敏的分子机制，也为理解离子通道中结构未解析区域的功能重要性提供了新的视角，为未来针对TRPA1相关疾病的治疗策略开发奠定了重要基础。