脂质纳米颗粒表面蛋白冠降低mRNA递送效率的作用机制与功能影响研究

本研究针对脂质纳米颗粒(LNP)在体内形成蛋白冠影响其mRNA递送效率的关键问题，开发了基于连续密度梯度超速离心与无标记质谱的蛋白冠分离鉴定新方法。研究人员发现Vitronectin(VTN)、C反应蛋白(CRP)和α-2-巨球蛋白(A2M)等蛋白在LNP表面特异性富集，并通过体外实验证明这些蛋白冠虽然增加细胞摄取，但通过促进溶酶体 trafficking 反而降低mRNA表达效率。该研究为理性设计LNP递送系统提供了重要理论基础。

脂质纳米颗粒(LNP)作为最先进的非病毒RNA递送载体，已在siRNA治疗肝淀粉样变性和mRNA新冠疫苗等领域取得临床成功。然而，LNP在静脉注射后主要被肝脏摄取，难以实现肝外器官的特异性递送。更关键的是，当LNP进入体内后，会立即与生物流体中的蛋白质相互作用形成"蛋白冠"，这种表面蛋白层会重新定义LNP的理化性质并影响其递送效果。但由于技术挑战，特别是生物样本中内源性纳米颗粒的存在，使得LNP蛋白冠的研究一直面临重大困难。

为了突破这一瓶颈，加州大学伯克利分校的Elizabeth Voke等研究人员在《Nature Communications》上发表了创新性研究成果。团队开发了一种定量、无标记的质谱蛋白质组学方法，能够精确表征LNP表面的蛋白冠组成。这种方法的关键创新在于避免了人生物体液中内源性纳米颗粒引入的假象，通过连续密度梯度超速离心分离蛋白-LNP复合物，并结合质谱进行蛋白质鉴定。

研究采用的主要技术方法包括：使用连续碘克沙醇密度梯度超速离心(36,000 rpm，16小时)分离LNP-蛋白复合物；通过动态光散射(DLS)评估纳米颗粒稳定性；利用无标记液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白质鉴定和定量；采用人源肝细胞系HepG2进行细胞摄取和内体逃逸效率评估；结合共聚焦显微镜和流式细胞术分析细胞内在化过程。

Limitations of current methods for protein corona characterization on LNPs

研究人员首先系统分析了现有蛋白冠表征方法的技术局限。传统超速离心方法会导致低密度脂质纳米颗粒聚集或破坏，而尺寸排阻色谱(SEC)无法有效分离内源性颗粒。研究团队发现，通过优化离心条件(16小时代替常规的3-4小时)，能够实现LNP与丰富血浆蛋白和内源性纳米颗粒的有效分离。

Proteomic characterization of the protein corona isolated from LNPs

通过蛋白质组学分析，团队从LNP蛋白冠中鉴定出56种蛋白质，其中39种在LNP表面显著富集。基因本体分析显示这些蛋白与先天和适应性免疫反应、脂质转运和代谢密切相关。值得注意的是，虽然载脂蛋白AI(ApoA-I)和ApoA-II是血浆中最丰富的载脂蛋白，但它们并未在LNP蛋白冠中富集，表明该方法能够选择性识别真正与LNP相互作用的蛋白质。

Effect of proteins enriched in the LNP corona on LNP function

研究人员重点研究了 consistently 富集的三种蛋白：α-2-巨球蛋白(A2M)、C反应蛋白(CRP)和玻连蛋白(VTN)。令人惊讶的是，虽然预孵育了ApoE的LNP细胞摄取增加了5倍，但mRNA表达水平没有显著变化。而预孵育VTN或CRP的LNP虽然显示细胞摄取增加，但mRNA表达分别降低了50%和90%。这种细胞摄取与mRNA表达之间的不匹配现象揭示了蛋白冠对LNP功能的重要影响。

Protein-nanoparticle interactions impact nanoparticle functionality

通过共聚焦显微镜和流式细胞术分析，团队发现预形成ApoE、VTN或混合蛋白冠的LNP都显示出显著增加的细胞摄取，但溶酶体共定位分析表明这些LNP更多被运输到溶酶体进行降解。特别是ApoE-LNP的溶酶体共定位增加了2.9倍，混合蛋白冠LNP增加了4倍，这解释了为什么增加的细胞摄取没有转化为更高的mRNA表达效率。

研究结论表明，LNP表面形成的蛋白冠不仅影响细胞摄取过程，更重要的是调控了细胞内运输命运。某些蛋白冠(如VTN和CRP)虽然促进细胞摄取，但通过引导LNP进入溶酶体降解途径，反而损害了mRNA递送效率。这一发现对LNP的理性设计具有重要指导意义：仅仅提高细胞摄取不足以保证递送效率，必须同时考虑蛋白冠对细胞内运输的影响。

该研究的重要意义在于首次建立了可靠地LNP蛋白冠分离和鉴定方法，并揭示了蛋白冠影响LNP功能的具体机制。研究结果提示，未来的LNP设计需要考虑如何调控蛋白冠组成以避免溶酶体运输，或利用特定蛋白冠实现器官选择性靶向。这项工作为开发下一代高效、靶向的LNP递送系统提供了关键科学基础。