COOKIE-Pro：蛋白质组尺度共价抑制剂结合动力学分析新方法揭示靶向治疗新机制

本研究针对共价抑制剂结合动力学与选择性全面分析的难题，开发了COOKIE-Pro方法，通过两步孵育过程结合质谱蛋白质组学技术，实现了全蛋白质组尺度不可逆共价抑制剂kinact和KI值的精准测定。该方法成功应用于BTK抑制剂spebrutinib和ibrutinib的动力学分析，发现spebrutinib对TEC激酶的效力比BTK高10倍以上，并通过16个共价片段库筛选获得数千个动力学谱，为共价药物的临床前优化提供了强大工具。

在药物研发领域，共价抑制剂正以其独特的作用机制焕发新生。从最早的阿司匹林到如今备受关注的BTK抑制剂ibrutinib，这类通过与靶蛋白形成不可逆共价键的药物，展现出持久的药效和强大的治疗潜力。然而，如何系统评估共价抑制剂在复杂生物系统中的结合动力学和选择性，一直是困扰研究人员的难题。传统方法需要针对每个靶蛋白单独建立活性检测体系，耗时费力且难以发现未知的脱靶效应。

针对这一挑战，研究人员在《Nature Communications》发表了创新性研究方法COOKIE-Pro（COvalent Occupancy KInetic Enrichment via Proteomics）。这种方法巧妙地结合了两步孵育流程和质谱蛋白质组学技术，能够在全蛋白质组范围内无偏倚地定量不可逆共价抑制剂的结合动力学参数。

研究团队采用了几项关键技术：首先使用透化细胞（Ramos细胞系）保持蛋白质天然环境，避免细胞裂解物带来的变异性；其次设计并验证了与目标化合物匹配的脱硫生物素探针（如SB-2用于spebrutinib，IB-C8-DTB用于ibrutinib）；通过TMT多重标记定量技术实现高通量蛋白质定量；最后开发了专门的数据分析算法，能够从有限的实验数据点准确计算kinact和K_I值。

Design of COOKIE-Pro workflow

研究人员通过数学推导建立了共价占据率与时间和浓度的关系模型，采用两步拟合策略：首先通过单相结合拟合获得表观k_obs值，再通过米氏模型拟合同时得到k_inact和K_I值。MATLAB模拟验证该方法适用于各种亲和力和反应性的化合物。

Benchmarking COOKIE-Pro with high selectivity BTK covalent inhibitor spebrutinib

使用高选择性BTK抑制剂spebrutinib进行方法验证，发现该方法准确重现了已知动力学参数（k_inact/K_I=9.15±0.62×10⁴ M^-1s^-1），同时揭示spebrutinib对TEC激酶的效力比BTK高10倍以上（k_inact/K_I=7.06±2.48×10⁵ M^-1s^-1）。

Optimizing COOKIE-Pro workflow with low selectivity BTK covalent inhibitor ibrutinib

应用ibrutinib这一低选择性抑制剂时，研究人员优化了探针设计策略，发现应避免对warhead部分的修饰，并确定了最佳探针浓度（1μM）和连接子长度（C8），同时发现0.1% SDS变性条件能显著提高pull-down效率。

COOKIE-Pro strategy is compatible with SLC-ABPP dataset

研究证明COOKIE-Pro与SLC-ABPP数据集兼容，能够将竞争比（CR）值转化为热力学结合常数K_I。分析发现氯乙酰胺warhead的k_inact中位数为0.0092s^-1，而丙烯酰胺warhead为0.0025s^-1，解释了前者能标记更多可配体半胱氨酸的原因。

Increase throughput using two data points to estimate k_inact and K_I values

团队开发了两点COOKIE-Pro策略，将样品数量从17个减少到7个，通过AIC/BIC标准选择最佳拟合模型（线性、双曲线或常数模型），大幅提高了通量。

Applying two-point COOKIE-Pro strategy to profile binding kinetics for covalent fragment screening

应用两点策略筛选16个共价片段，获得了272,005个片段-DBIA肽段对的定量数据，其中5,664个曲线成功通过双曲线模型拟合。研究发现异恶唑分子模式具有高结合效率，TXNDC家族蛋白中的半胱氨酸位点显示出极高的失活效率，主要源于其高内在反应性而非强非共价亲和力。

本研究开发的COOKIE-Pro方法代表了共价抑制剂研究领域的重大进展，解决了全蛋白质组尺度结合动力学分析的难题。该方法不仅能够准确测定已知靶点的动力学参数，还能发现未知脱靶作用，为共价药物的选择性优化提供了强大工具。两点筛选策略的实现更是将这一技术推向了高通量应用层面，为大规模共价片段筛选和先导化合物优化提供了新的技术路径。通过将化学反应性与非共价亲和力解耦分析，研究人员能够更理性地设计选择性更高的共价药物，最终推动更安全、更有效的共价疗法的发展。