单核转录组学揭示青蒿腺毛形态建成与青蒿素生物合成的细胞图谱

本研究针对青蒿腺毛发育机制及青蒿素细胞起源不明确的关键问题，采用单核RNA测序与空间转录组学技术，构建了高分辨率细胞图谱解析代谢动态。研究发现青蒿素主要在10细胞腺毛结构中的6个特定分泌细胞中合成，鉴定出数百个调控腺毛发育或青蒿素生物合成的枢纽基因，系统阐明了青蒿腺毛发育与青蒿素生物合成的空间生产机制，为代谢工程和基础腺毛生物学提供了重要的细胞与遗传基础。

青蒿素是一种含有内过氧化物桥的倍半萜内酯，作为青蒿素联合疗法(ACTs)的基石，是世界卫生组织推荐的恶性疟原虫疟疾一线治疗药物。除了抗疟功效，新证据表明青蒿素及其衍生物对多种疾病具有治疗潜力，显著扩展了其临床相关性。这种多方面的生物活性化合物来源于青蒿(Asteraceae)，其特化的腺毛分泌腺体(GSTs)是青蒿素生物合成的工厂。这些表皮结构是青蒿素合成、分泌和储存的多功能位点，因此GST密度、发育成熟度和代谢效率关键性地决定产量。

尽管青蒿素生物合成途径从前体分子异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)开始，分别通过质体中空间区室化的甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径和细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径合成，但从法尼基焦磷酸(FPP)到二氢青蒿酸(DHAA)的酶促级联反应已被部分阐明，涉及紫穗槐二烯合成酶(ADS)、细胞色素P450单加氧酶CYP71AV1、醇脱氢酶1(ADH1)、双键还原酶2(DBR2)和醛脱氢酶1(ALDH1)。最近，二氢青蒿酸脱氢酶(AaDHAADH)被鉴定出来，它催化青蒿酸(AA)和DHAA之间的双向转化，但从DHAA到青蒿素的最终转化在机制上仍不明确。特别有争议的是最终转化是否完全涉及非酶光氧化或需要未发现的酶催化，这一关键知识缺口阻碍了微生物生物工程方法。

除了青蒿素生物合成，青蒿的GSTs作为进化优化的代谢中心，产生商业上重要的特化代谢物，包括单萜、倍半萜、黄酮类、脂肪族化合物、香豆素和精油。这些分泌微器官代表了一种系统发育上保守的适应，作为对人类社会至关重要的生物活性化合物的专用生物合成工厂。这种功能趋同的例证包括大麻中的大麻素、烟草中的尼古丁、加拿大薄荷中的薄荷醇和番茄中的α-番茄碱。尽管对青蒿GST中青蒿素生物合成进行了二十年的研究，对这些多细胞“化学工厂”的基本理解仍然零碎，部分原因是腺毛发育的分子编程和代谢专业化仍然不明确。虽然非腺毛在拟南芥等模式系统中得到了很好的表征，但青蒿GST形态发生和代谢专业化的机制仍然不清楚。因此，系统理解GST发育，将形态发生与特化代谢的时空控制整合起来是必不可少的。这种知识对于最大化青蒿素生产和释放植物物种中未表征的GST衍生代谢物的生物技术潜力都至关重要。

GST的结构复杂性和多样性在植物中很明显。例如，番茄具有七种不同的毛状体类型，其中四种(类型I、IV、VI和VII)是GSTs。烟草包含两种类型的GSTs(长腺毛和短腺毛)。在青蒿中，存在单一GST类型，但它由十个细胞组成，组织成特化的亚结构。具体来说，这些GSTs由两个柄细胞(SCs)、两个基细胞(BCs)和六个分泌细胞组成，分成两个顶端分泌细胞(ACs)和四个亚顶端分泌细胞(SAs)，围绕一个皮下腔。

本研究开创性地整合单核RNA测序(snRNA-seq)与空间转录组学，解析了青蒿GST的发育-代谢连续体，为植物分泌结构研究建立了一个变革性框架。研究验证了四个GST特异性标记基因，并鉴定出数百个有前景的枢纽基因，可能调控青蒿素生物合成或毛状体发育，提供了对植物分泌结构功能多样化和区室化以及特化次级代谢物生物合成背后代谢组 orchestration 的机制见解。

研究人员通过多证据整合策略精确注释了15个转录组簇，包括：(1)GUS染色验证的青蒿GST独家基因；(2)来自正交系统的进化保守标记基因；(3)基于皮尔逊相关的簇亲缘关系分析。四个簇(7,11,12,14)通过两个标志性特征明确识别为GST：在毛状体相关区域的空间富集和GST特异性基因(AaGSW1、AaGSW2、ADS、DBR2、CYP71AV1、ALDH1、ADH1)的高表达。簇8,9,15显示与GST发育接近但缺乏特征性GST标记，定义为T形非腺毛(TT)。基于拟南芥中报告的标记基因表达模式，簇3,13,6和2分别注释为表皮细胞(EC)、保卫细胞(GC)、维管细胞(VC)和增殖细胞(PC)。簇1,4,5和10识别为叶肉细胞(MC)。最终 delineated 七个不同的细胞群体。

三个GST特异性细胞标记(AA618140、AA036960和AA529190)的空间分辨RNA原位杂交证实了注释准确性。此外，通过分析不同细胞群体中的差异表达基因并通过qRT-PCR验证，鉴定了多种细胞类型标记基因。这些发现为研究青蒿叶和GST的发育过程以及与这些细胞类型相关的特化代谢途径提供了宝贵的资源。

青蒿叶的空间转录组学作图解析了GST/TT空间结构并验证了七个snRNA-seq簇。考虑到青蒿叶的独特解剖特征，研究人员开发了用于冰冻切片和组织透化的特定方案，建立了在这种药用物种中进行空间转录组学的优化工作流程。从叶片样本中，获得了8.49亿个测序读数，96.1%的条形码被识别为有效，确保了高质量数据。选择了四个具有完整形态的密集GST的叶片进行14μm分辨率的高分辨率空间转录组分析，产生了1,178个空间分辨转录组点和25,162个检测到的基因。

空间聚类分析揭示了五个不同的组织域：EC/TT(簇0)、MC(簇1)、GST(簇2)和VC/PC(簇3和4)。UMAP可视化显示空间分离的GST域靠近TT/EC但不同于其他细胞类型，其分布模式与snRNA-seq投影一致。差异基因表达分析鉴定了簇特异性标记，其中GST富集的簇2显示萜类生物合成途径组分的显著高表达。涉及青蒿素(倍半萜)生物合成的四种关键酶(ADS、ALDH1、DBR2、ADH1)和负责单萜生物合成的两种莰烯合成酶(AA068290、AA251590)位列GST标记的前十名。通过RNA原位杂交的空间验证揭示了GST标记基因AA050580的特异性表达，并最终证实了簇2的GST身份。

通过基于锚点的snRNA-seq和空间转录组学整合，研究人员将细粒度亚群体映射到组织坐标。值得注意的是，GST空间分区模式在模态间一致，并且GST内的青蒿素生物合成基因(FPS、ADS、CYP71AV1、ADH1、ALDH1、DBR2、CPR)显示一致表达，验证了跨模态对齐捕获的生物相关生态位。此外，使用了四种分析工具构建计算框架以链接空间和单核转录组数据集。SingleR和SciBet分析显示，snRNA-seq数据中的GST簇与空间转录组学数据中的簇2表现出最强的相关性。然而，细胞类型分类在两种方法间存在分歧：SingleR将GST与PC分组，而SciBet将GST与EC关联。RCTD和CARD分析得出一致结果，GST空间定位与SingleR和SciBet发现一致。这些整合分析一致证实了snRNA-seq数据中GST簇注释的准确性，为后续研究提供了可靠基础。

控制GST和TT的分化机制，两者都是表皮衍生物，仍然不完全理解，特别是关于GST成熟过程中的代谢专业化。为了解决这一差距，使用伪时序分析重建细胞分化层次并识别调控基因网络。将此方法应用于青蒿EC、GST和TT揭示了一个分叉的发育轨迹。表皮祖细胞沿着伪时间轴分叉成GST和TT谱系。基因表达动态 across 这个发育轨迹为未来研究提供了分子资源。模块4基因在伪时间轴中期表现出高表达，主要涉及细胞壁组织、纤维素生物合成过程和脂质分解代谢过程。值得注意的是，模块1功能上与GST形态发生相关，表现出萜类生物合成过程和脂肪酸代谢网络的分层激活，其中 de novo 脂肪酸生物合成作为最富集的途径出现。这种代谢特征突出脂肪酸代谢作为GST发育的核心协调者，可能协调GST萜类合成的前体供应和分泌细胞分化过程中的动态膜生物合成。

研究人员对GST相关簇的精细重聚类识别了七个不同的亚簇(G1-G7)。值得注意的是，G6和G7(分别为21和22个细胞)显示出明显低于其他簇的细胞丰度，表明它们在关键发育转变中作为短寿命中间体的作用。基于细胞簇平均基因表达谱的皮尔逊相关系数分析显示，G1、G3、G5和G7表现出强烈的共表达模式，如它们的高相关系数所证明，表明共享的发育起源和保守的功能特征。G2、G4和G6形成另一个簇。

通过整合光合基因表达谱和细胞间相关网络，基于Duke等人的发育框架，注释了七个GST亚簇(G1-G7)。G5由于最小光合基因表达(1.9%)被注释为AC。G1被识别为SA，是最丰富的(554个细胞)并表达更多光合基因(10.6%)。G7与G1强相关，也被注释为SA。G3被识别为BC，缺乏可检测的光合基因表达并与分泌细胞聚类，可能作为GST结构维持和物质运输的支持细胞。G2被注释为SC，显示与分泌细胞低相关但表达一些光合基因(1.7%)。G6特异性表达H2A，一个经典的增殖标记。同时，GO富集分析显示G4主要功能在翻译、翻译延伸、角质生物合成、脂肪酸代谢和植物表皮形态发生。G4和G6之间强烈的皮尔逊相关系数进一步支持了它们的生物学相似性。因此，G4和G6被注释为未成熟GST细胞(IGCs)。

伪时序轨迹分析阐明了GST亚群体的发育进程，揭示了GST发育过程中至少三个不同的功能状态。起始阶段(G4/G6, IGC)主要与基本细胞过程相关，包括翻译(GO:0006412)、核小体组装(GO:0006334)和细胞质翻译(GO:0002181)，为后续发育建立必要的细胞机器。中间阶段(G2/G3/G1, SC, BC, and SA)表现出向脂质代谢的代谢转变，以脂肪酸生物合成过程(GO:0006633)、蜡生物合成过程(GO:0010025)和极长链脂肪酸生物合成过程(GO:0042761)的激活为标志。值得注意的是，这个阶段共同表达活跃的光合途径(GO:0018298, GO:0009768, GO:0015979)以及这些生物合成过程，展示了这个过渡阶段的同时代谢能力。最显著的是，发育晚期(G5/G7簇, SA and AC)表现出特化代谢途径的上调，特别是萜类生物合成(GO:0016114)和脂肪酸代谢(GO:0006633)。这种分子谱与次级代谢物生产的特化生物合成区室的进化作用一致。

通过伪时序分析重建发育轨迹能够确定GST发育过程中青蒿素生物合成关键基因的动态表达。四种下游青蒿素合成关键基因的表达随着毛状体发育逐渐增加。通过解析GST成熟的伪时间结构，我们的工作提供了对GST发育过程中动态功能转变的前所未有的见解，提供了一个 refined 框架用于理解其分化和成熟的协调机制。

虽然GSTs被认为是青蒿中青蒿素的主要生物合成位点，但其10细胞结构内的精确细胞专业化仍然未解决。进行了所有已知青蒿素生物合成途径关键基因的单核转录组分析以确定细胞类型特异性生物合成。GST簇(C7,C11,C12,C14)显示上游萜类前体途径(MVA和MEP)和下游生物合成基因(FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2)的协调高表达，而表皮和叶肉细胞显示可忽略的途径活性。这些结果最终证明了青蒿素生物合成在青蒿GST细胞内的进化区室化。

青蒿素生物合成途径的整合分析，跨越萜类前体途径(MVA/MEP)和下游基因，跨GST亚簇显示细胞类型特异性代谢分区。ACs和SAs表现出前体途径和所有已知下游酶组分(ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2)的协调上调，表明它们自主生产青蒿素生物合成酶前体的能力。相反，基细胞(BCs)显示晚期基因(FPS、ADS、CYP71AV1、DBR2)的表达减弱但维持早期MVA途径基因(HMGS、HMGR)的活跃转录，表明在为邻近分泌细胞提供前体方面的特化作用。显著地，SCs和IGCs显示整个途径的最小转录活性，证实了它们被代谢排除在青蒿素生产之外。高分辨率单核RNA-seq空间作图明确将青蒿素生产限制在青蒿GSTs内的六个特化分泌细胞，确立这些区室作为这种抗疟化合物的主要生物合成位点。

此外，研究人员在单核分辨率分析了48个先前报告的与GST起始或青蒿素生物合成相关的转录因子(TFs)的表达模式。图5b说明了所有青蒿叶细胞类型和GST亚簇内代表性TF表达谱。GST起始的关键调节因子，如AaTLR3、AaTAR1、AaMIXTA1和AaWIN1，在IGCs和/或SCs中显示高表达。相反，调节青蒿素生物合成的TFs，包括AabHLH1、AaMYC2、AaWRKY9、AaBBX21、AaGSW1、AaWRKY17，在ACs和SAs中显示高表达。值得注意的是，BCs共同表达调节青蒿素生物合成的TFs(AaABI5、AaERF1、AaMYB108)。

研究人员的snRNA-seq数据与已发表的GUS定位研究 corroborated。通过GUS assays验证为GST特异性表达的TFs，如AaGSW1和AaGSW2，在scRNA-seq数据中也显示簇特异性富集在GST中。记录在TT中表达的TFs(AaMYB16、AaTAR1、AaABF3)在相应snRNA-seq簇中显示高表达。类似地，通过GUS染色在叶肉细胞中观察到的AaTCP15表达在C簇中得到确认。虽然AaTCP14被报告表现出非特异性染色但高毛状体表达，分析精确地将其高表达定位到SA和PC。

在单核分辨率解析了时空模式。青蒿素调节因子AaHY5和AabZIP1在IGCs中显示高表达。水杨酸相关的bZIP TF TGA6在IGCs和SAs中均高表达。有趣的是，虽然AaGSW2(一个报告的GST起始因子)在整体GST簇中显示高表达，亚簇分析揭示其在ACs和SAs中的特异性富集而不是柄或IGCs。这表明AaGSW2可能作为一个多功能TF，可能调节分泌细胞代谢(如青蒿素生物合成)超出其在GST起始中的作用。一个值得注意的观察涉及AaMYB15，一个青蒿素生物合成的负调节因子，先前通过GUS染色定位到GSTs和TTs。数据证实了它在两种毛状体类型中的高表达，特别是在BCs中有强烈富集。这种表达模式进一步支持了BCs可能为分泌细胞中的青蒿素生物合成供应前体的假设。

青蒿GSTs跨发育阶段的 bulk RNA-seq 分析显示，与老GSTs相比，年轻GSTs中青蒿素生物合成基因的显著富集。这种转录特征通过发育阶段分辨代代谢组分析得到证实，揭示了精确协调的青蒿素积累动态，表明生物合成在GSTs的年轻分泌阶段最活跃，随着GST年龄增长合成速率逐渐下降。为了建立单核和 bulk 转录组数据集的稳健性，研究人员使用qRT-PCR进行了独立验证，以量化青蒿叶组织和GST富集样本中核心青蒿素生物合成基因的表达动态。定量分析证明了四种核心青蒿素生物合成基因(ADS、CYP71AV1、ALDH1、DBR2)的协调表达，在GST中相对于叶组织显著富集，并从年轻到老GSTs逐渐减弱。它证实了测序数据集的技术可重复性，同时为青蒿素生物合成中的细胞类型特异性代谢专业化提供了有力证据。

snRNA-seq与高清晰度加权基因共表达网络分析(hdWGCNA)的整合揭示了与GST发育和青蒿素生物合成相关的共表达基因模块，通过不同的共表达网络揭示了这些过程之间的功能协调。Scale-free 网络分析确定了一个最佳软阈值2(网络拟合指数=0.9)，产生了四个功能模块。每个模块内的核心基因通过基因连接性(kME)识别，模块特征基因(hMEs)被可视化。橙色模块在EC中主要表达，而棕色模块在GSTs中富集，表明空间专业化。

模块-性状关系证实了棕色模块与GST簇的强关联。功能富集揭示了模块核心在倍半萜生物合成关键的特化代谢途径中的富集：萜类生物合成、脂肪酸代谢、异戊烯二磷酸代谢和黄酮类生物合成过程，表明其与青蒿素生物合成途径的密切关联。不同地，橙色模块与EC、TT和GST簇广泛关联，并在角质层生物合成、极长链脂肪酸(VLCFA)代谢、脂质分解代谢和植物表皮形态发生中富集。这种空间分区，其中角质层相关过程先于GST专业化，表明代谢准备可能促进后续发育转变。

使用开发的整合模块内连接性(kME)和与已知生物途径关联的评分系统，研究人员为棕色和橙色模块中前30%的枢纽基因建立了相互作用网络。显著地，网络整合了上游(MEP)途径基因(DXS、HDS)和六个下游酶基因(ADS、CYP71AV1、ADH1、ALDH1、DBR2、CPR)，它们共同跨越完整的青蒿素生物合成级联。此外，网络包含一个ABC转运蛋白基因(PDR1, AA090620)，在烟草中功能验证用于青蒿酸运输。青蒿素生物合成途径关键基因的全面覆盖显著增强了构建网络的可靠性和生物学相关性。

从棕色和橙色模块中优先选择了六个基因作为影响青蒿素生物合成或GST起始/发育的关键候选基因，特别是考虑到GST细胞内质体的独特结构和功能专业化。在棕色模块中，AA013090(基于序列同源性注释为光系统天线蛋白-like)与核心青蒿素生物合成基因共表达。虽然其在GST质体中的确切作用仍未验证，该基因可能有助于光依赖过程，间接支持青蒿素生产。这一作用得到烟草突变体研究的支持，其中光捕获叶绿素a/b结合蛋白(LHCB)的缺失完全取消了腺体分泌能力。作为烟草LHCB的直接直系同源物，两个系统中收敛的GST功能障碍强调了GST活动对光系统组分的关键依赖性。此外，AA244300(注释为二甲基苯胺单加氧酶)可能涉及青蒿素中间体的氧化修饰。两个醛脱氢酶家族基因(AA036960和AA405270)可能通过调节氧化还原酶活性(作用于供体的醛或氧代基团，以NAD或NADP作为受体)影响青蒿素合成。橙色模块候选基因包括AA393400(注释为Lipase, GDSL)和AA372410(非特异性脂质转移蛋白3)。两个基因可能在对角质层和蜡代谢关键的过程中功能，从而影响GST起始和物理完整性。空间表达谱确认了功能相关性；棕色模块候选基因显示GST富集，而橙色模块候选基因在EC/TT/GST细胞类型中广泛表达。qRT-PCR验证进一步证明AA036960、AA013090和AA244300表现出与四种核心青蒿素基因一致的表达模式。值得注意的是，AA036960通过RNA原位杂交验证为GST的标记基因。更全面的功能验证研究使用CRISPR-Cas9敲除目前正在进行中。

单细胞转录组学的进展革命化了分子遗传学，为理解特化代谢的细胞区室化提供了前所未有的机会。在这里，研究人员建立了青蒿GST的单核图谱，解析了青蒿素生物合成途径的空间组织。snRNA-seq与空间转录组学的整合产生了青蒿GST在单核水平的高分辨率时空数据集。该数据集为发现青蒿素生物合成中未知途径和阐明GSTs的发育机制奠定了基础，同时也作为理解其他物种中GST形态发生和调控机制的模型。它还提供了对天然产物细胞特异性合成的见解。

青蒿GSTs的scRNA-seq提出了一个重大挑战。GSTs构成少于1%的叶细胞。成熟GSTs小，封装在角质壳中，并显示代谢物储存细胞典型的降低转录活性。常规酶法由于结构抵抗力和低RNA可及性未能分离完整GST原生质体，导致研究人员开发了优化的机械-酶工作流程。专注于S1-S2发育阶段，其中GST形成和峰值生物合成重合，处理了超过400片叶子。这产生了一个高分辨率单核图谱，具有1,864个GST核和1,469个TT核，解析了七个代表已知亚型的不同细胞群体。虽然空间转录组学从有限切片中仅捕获约200个毛状体细胞，但snRNA-seq在跨阶段分析了1,864个细胞。这种差异源于固有的生物学限制。GSTs是随机分布的，小于标准切片厚度，并受到密集代谢物和角质层的阻碍，限制了捕获效率尽管优化努力。RNA原位杂交证实了数据集准确性并识别了四个GST标记基因。这种整合方法克服了技术障碍，确立了青蒿作为特化代谢的细胞分辨率模型。

研究人员的图谱揭示了GSTs内前所未有的功能专业化。青蒿素生物合成进化上区室化到分泌细胞(SAs和ACs)， specifically 到仅六个特化分泌细胞，拥有所有当前已知的 de novo 生产酶机器。BCs表达早期MVA基因但显示晚期基因表达减少，表明在供应前体给邻近分泌细胞方面的潜在作用。这表明通过途径区室化优化资源分配的进化策略。显著地，SCs和IGCs显示最小的青蒿素途径基因表达，证实代谢活动严格限制在成熟分泌细胞。使用单核分辨率，研究人员澄清了转录因子表达和定位的 distinct 空间特异性。例如，AaGSW2先前被认为广泛表达， specifically 在顶端/亚顶端细胞中富集，表明在调节分泌代谢中的潜在双重作用。阻遏物AaMYB15在基细胞中的高表达进一步支持了它们参与前体供应。这些发现解决了青蒿素合成的细胞基础，并为代谢工程提供了精确目标。

伪时序轨迹分析定义了三个GST发育阶段。起始阶段通过激活基本代谢途径建立基本细胞机器。中间阶段激活脂质代谢，协调脂肪酸和蜡生物合成以及光合作用。终端分化阶段通过空间分区萜类和脂质生物合成途径实现代谢专业化。这种级联与GST作为特化代谢物工厂的作用一致。

应用hdWGCNA识别了两个与GST发育和青蒿素生物合成相关的关键模块。棕色模块与GST簇共表达，包含所有已知核心青蒿素途径酶。显著地，该模块包含通过青蒿毛状体 bulk RNA-seq数据的WGCNA分析先前识别的五个候选枢纽基因中的三个，加强了其参与途径的核心作用，并表明 bulk 和单核方法之间的强烈一致性。这种收敛强烈表明该模块 orchestrate 青蒿素生物合成。

橙色模块与EC和毛状体相关。其在角质层生物合成、VLCFA代谢、脂质分解代谢和表皮形态发生中的富集与重建的GST轨迹和已知GST调控一致。角质层组成和其生物合成被AaMIXTA1激活，增强GST密度，证实了该模块的作用。TAR1调节青蒿素基因同时维持角质蜡，TLR3通过负调控角质层组织和分支约束代谢溢出。 together，那些验证了橙色模块在表皮结构完整性和脂质控制中的功能。研究人员推测通过这些角质层/脂质生物合成途径的通量可能产生信号分子(如脂质衍生信号)或建立一种允许的表皮环境，从而促进或影响控制GST命运规范的下游转录调控级联。为了功能研究这些模块并测试这一假设，其中的六个高评分基因正在通过CRISPR-Cas9敲除进行功能表征，其详细功能将在后续出版物中阐明。

本研究使用整合多组学方法在单细胞分辨率重建了青蒿GSTs的时空发育，并识别了调节青蒿素生物合成和GST发育的枢纽基因。为了克服先前其他物种毛状体研究的局限性，这些研究使用了具有少数GST细胞的 whole-leaf 样本，研究人员使用富集的GST样本和对照创建了一个GST图谱。该策略解决了当前缺乏类似富集GST图谱用于其他关键物种的问题。此类图谱对于跨物种整合以评估此处识别的GST机制的普遍性和进化保守性至关重要。未来工作应应用这种富集策略为多样化的GST代谢物生产物种创建高分辨率图谱。整合这些数据集将定义保守的发育程序和物种特异性适应。使用基因编辑对枢纽基因进行功能表征对于阐明它们在GST形态发生和青蒿素生物合成中的作用并测试它们的保守性至关重要。这项比较和功能基因组学工作构成了核心后续，完整验证将在后面详细说明。