真核生物DNA N6-腺嘌呤甲基转移酶复合物的底物识别机制——结构生物学揭示MTA1c介导6mA修饰的分子基础

本研究针对真核生物DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）修饰的底物识别机制不明确的问题，通过冷冻电镜解析了纤毛虫MTA1c复合物与未甲基化/半甲基化DNA底物的高分辨率结构。研究发现DNA被MTA1-MTA9二聚体和p1亚基钳形识别，目标腺嘌呤发生碱基翻转进入催化中心，揭示了6mA维持性甲基化的结构基础，为理解真核生物表观遗传调控提供了框架。

　　

在真核生物中，DNA N⁶-甲基腺嘌呤（6mA）修饰作为重要的表观遗传标记，在染色质动力学、基因表达调控和DNA损伤应答中发挥关键作用。尽管原核生物中6mA甲基转移酶（MTases）的识别机制已有较多研究，真核生物中这类酶如何特异性识别底物DNA仍不清楚。纤毛虫中的MTA1复合物（MTA1c）由MTA1、MTA9（或MTA9-B）、p1和p2四个亚基组成，可特异性催化双链DNA中ApT位点的腺嘌呤甲基化，并与核小体定位及有性生殖过程密切相关。然而，其底物识别和催化机制长期未得到阐明。

为解决这一问题，西湖大学施竹兵团队通过冷冻电镜技术解析了MTA1c与未甲基化（umDNA）和半甲基化（hmDNA）DNA底物复合物的高分辨率结构，系统揭示了该复合物识别不同甲基化状态DNA的分子机制，相关成果发表于《Nature Communications》。

研究采用的主要技术方法包括：通过大肠杆菌系统共表达并纯化Tetrahymena thermophila来源的MTA1c各组分；利用MTase-Glo酶活检测系统分析复合物对不同DNA底物的催化活性；通过荧光偏振和电泳迁移率变动实验测定DNA-蛋白结合亲和力；应用冷冻电镜单颗粒技术解析MTA1c与DNA、SAM/SAH的复合物结构，分辨率达2.5–3.3?；并借助点突变和体外功能实验验证关键残基的功能。

一、MTA1c复合物的生化特性与组装机制

研究发现MTA1c^MTA9-B对hmDNA的催化效率（k_cat=1.11 min^?1）显著高于umDNA（0.0102 min^?1），但两者结合亲和力相近（K_d分别为0.036μM和0.048μM），表明催化差异主要来源于化学步骤而非底物结合。SEC-MALS证实MTA1c与DNA以1:1化学计量比结合。突变实验表明MTA1催化亚基的D209A突变完全消除酶活，而p1和p2亚基对于全酶活性必不可少。

二、MTA1c–hmDNA复合物的结构基础

冷冻电镜结构显示，DNA结合于MTA1–MTA9二聚体表面，并被p1亚基的N端区域（NTR）钳形固定。目标脱氧腺苷（dA₀）从DNA双链中翻转出，进入由MTA1 gate loop 1（β2/α2环）、gate loop 2（β6/α4环）和β3–β5链围成的催化口袋，其N6原子与催化残基D209形成氢键，并与SAM的甲基集团密切接触，为亲核攻击创造几何条件。

DNA扭曲和碱基翻转由MTA1的H291和MTA9的Q380介导：H291插入双链，与靶链dG_-1/dT₁发生π–π堆积，并直接接触互补链上的m⁶A_-1′；Q380则锚定m⁶A_-1′和dC_1′。R221插入DNA双链分离m⁶A_-1′和dC_-2′，其胍基与dT₁、m⁶A_-1′形成氢键和静电相互作用。此外，MTA1的K286、K289和MTA9的R381通过离子配对与DNA磷酸骨架相互作用，稳定复合物构象。

三、p1 NTR在DNA识别中的核心作用

p1 NTR包含一个同源异型盒样结构域（HLD），其α3螺旋作为识别螺旋嵌入hmDNA的大沟。M64与靶链dA_-3碱基接触，Q61和R68与磷酸骨架相互作用，Y63与互补链dC_-2′形成氢键和疏水作用。p1的α2和α6螺旋也参与DNA结合，广泛覆盖DNA主沟和副沟表面。单独p1 NTR对umDNA和hmDNA的K_d值（0.037μM和0.035μM）与全复合物相当，表明p1在初始底物识别中起主导作用。突变其关键DNA结合残基（K44/K46、M64/R68、K114/K117）显著削弱MTA1c酶活。

四、umDNA与hmDNA识别的构象差异

结构比较表明，hmDNA结合时MTA1c呈现更稳定的构象，而umDNA结合则显示动态性和局部无序，尤其MTA1 gate loop 1在umDNA复合物中往往不可见。hmDNA的熔点温度（T_m=48.4°C）低于umDNA（54.3°C），表明6mA修饰本身 destabilizes DNA双链，降低了碱基翻转的能垒，这解释了MTA1c对hmDNA的催化偏好性，提示其可能主要作为维持性甲基化酶发挥作用。

五、与细菌MTases及真核MT-A70家族的结构比较

MTA1c与细菌6mA MTases（如CcrM和EcoP15I Mod）虽具有相似的整体折叠，但催化口袋局部构象显著不同：细菌酶利用[D/N]PPY motif中的酪氨酸与靶腺嘌呤堆叠，而MTA1则通过W212和I254共同稳定翻转碱基。与真核MT-A70家族成员（如METTL3–METTL14 RNA甲基转移酶复合物和METTL4）比较发现，这些酶均共享三个功能模块：稳定SAM结合口袋的模块、增强底物招募的识别模块以及维持底物结合环活性的调控模块，尽管各酶在亚基组成和底物偏好上存在分化。

结论与意义

该研究首次揭示了真核生物DNA 6mA甲基转移酶复合物与底物DNA的高分辨率结构，阐明了MTA1c通过多亚基协作实现底物识别、碱基翻转和催化反应的分子机制。其主要意义在于：1）发现p1 NTR作为关键DNA钳形识别模块，主导初始底物招募；2）揭示6mA存在通过降低DNA稳定性促进维持性甲基化的变构机制；3）阐明MTA1c与细菌MTases的进化分化关系，提出MT-A70家族酶类虽底物不同但共享保守功能模块的假说；4）为针对6mA相关疾病（如癌症和发育障碍）的靶向干预提供了结构基础。该工作不仅推进了对真核生物DNA甲基化调控的理解，也为研究其他核酸修饰酶提供了范式。