几何工程化人类运动组装体芯片实现神经肌肉互作读取与缺氧驱动疾病建模

本研究针对间歇性缺氧(IH)相关呼吸系统疾病中神经肌肉损伤机制不明的难题，开发了基于几何约束的人类运动组装体芯片模型。通过简化表面修饰工程实现空间模式化组装体构建，证实IH通过靶向线粒体生物能量代谢（尤其是NAD+补救途径）导致神经肌肉功能失调，为临床治疗提供了新靶点和评价平台。

在呼吸系统疾病领域，慢性阻塞性肺疾病(COPD)和阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)等患者普遍面临着一个严峻挑战——间歇性缺氧(intermittent hypoxia, IH)。这种周期性缺氧与正常氧浓度交替出现的病理状态，不仅影响呼吸功能，更会导致神经肌肉系统损伤，表现为肌肉疲劳、收缩力下降甚至纤维类型转化。然而，由于临床研究存在多重混杂因素，动物模型存在种属差异，传统二维细胞模型缺乏生理相关性，科学家们一直难以揭示IH影响人类神经肌肉系统的直接证据和分子机制。

正是在这样的背景下，研究人员在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。他们成功开发了一种几何工程化的人类运动组装体芯片平台，通过巧妙的表面修饰技术，在聚二甲基硅氧烷(PDMS)器件上创建了差异化的组织粘附强度，实现了各向异性人类骨骼肌类器官(human skeletal muscle organoids, hSkM)和人类运动神经元球体(human motor neuron spheroids, hMNS)的空间模式化自组装。这个平台不仅再现了神经肌肉连接的生理环境，还为研究IH驱动的疾病机制提供了理想模型。

研究团队运用了几项关键技术：基于人诱导多能干细胞(hiPSCs)的脊髓运动神经元分化技术、区域特异性表面修饰技术（使用Pluronic-127和Sulfo-SANPAH）、三维神经肌肉组装体共培养系统、光遗传学操控技术、微电极阵列(microelectrode array, MEA)电生理记录技术以及间歇性缺氧体外模拟系统。所有细胞样本均来源于人诱导多能干细胞。

几何工程和人类运动组装体芯片的生成

研究人员首先通过时序性添加特定信号分子，从hiPSCs成功分化出表达OLIG2+的运动神经元祖细胞(motor neuron progenitors, MNP)，最终获得成熟的功能性运动神经元球体。利用表面修饰技术在PDMS器件上创建差异化粘附区域：中间区域使用Pluronic-127防止非特异性粘附，而锚定点区域使用Sulfo-SANPAH促进ECM蛋白共价连接。这种设计使hSkM细胞在几何约束下自组织成对齐的肌束结构，成功率达到90.96%，显著高于未修饰组。各向异性模型中的肌纤维呈现高度有序排列，而神经元突触生长则呈现放射状分布，不受方向性约束。

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功能组分在运动组装体中的协同出现和耦合

研究表明hMNS的存在显著增强了hSkM中I型和II型肌球蛋白重链(MHC-I和MHC-II)的表达，特别是促进了与高耐力和氧化代谢能力相关的II型肌纤维基因表达。同时，骨骼肌对运动神经元发育也表现出逆行性调节作用，增强了快慢运动神经元亚型的多样性。RNA测序分析显示，与未受神经支配的hSkM模型相比，组装体模型中3364个基因上调，2334个基因下调，涉及肌肉发育和神经肌肉接头(neuromuscular junction, NMJ)形成的关键基因显著富集。

人类运动组装体的功能表征

组装体表现出自发性收缩活动，靠近hMNS区域的收缩位移更大。通过光遗传学刺激表达hChR2(H134R)的hMNS，可触发同步的肌肉收缩。MEA记录显示，光遗传刺激后多个电极检测到同步峰电位响应，证实了hMNS与hSkM之间的功能连接。此外，研究还发现组装后的hMNS之间形成了投射互连网络，中枢神经球体的光遗传激活可有效信号传递至相邻神经球体。

IH诱导的功能缺陷作为运动神经元对缺氧的初始反应

暴露于IH环境后，早期发育阶段的运动神经元簇结构完整性受损，形成更扁平、不规则的形态。电生理功能检测显示，IH主要破坏发育早期的表型，但影响两个阶段(IH p1和p2)的功能读数。成熟hMNS在IH暴露下表现出神经元兴奋性和网络同步性受损，平均放电率、爆发次数和同步指数均下调。有趣的是，轴突生长未受IH影响，表明神经功能比结构对缺氧更敏感。IH还触发了氧化应激反应，活性氧(reactive oxygen species, ROS)从集中区域向球体更广泛区域重新分布。

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人类运动组装体芯片通过表型和功能读数研究IH驱动疾病模型中的神经肌肉病理学

IH暴露4天后，hSkM中的SAA+多核肌纤维出现共存的肌纤维萎缩和肥大伴空泡化，纤维直径呈双峰分布。NMJ长度显著减少，收缩功能逐渐减弱。蛋白表达分析显示，慢肌纤维相关蛋白MHC-I和SAA在第4天显著减少，而快肌纤维标志MHC-II先短暂升高后下降。神经结构蛋白中，神经丝轻链(neurofilament light chain, NFL)逐渐下降，中分子量神经丝(neurofilament medium, NFM)短暂下降后恢复，而神经丝重链(neurofilament heavy, NFH)和TUJI对IH具有抵抗力。MEA记录显示，从第2天开始自发电活动下降，光遗传刺激仍能引发同步放电，但某些电极从持续放电转变为减弱。

缺氧驱动病理机制的解析和靶向NAD+代谢的治疗尝试

转录组分析发现IH诱导545个转录本上调，205个转录本下调，KEGG富集分析显示HIF-1信号通路激活。线粒体复合物I(NADH:泛醌氧化还原酶)在mRNA和蛋白水平以及酶活性上均显著抑制，ATP合酶活性及其亚基(ATP5B)mRNA也受抑制。NAD+水平和NAD+/NADH比率下降。研究人员测试了针对NAD+补救途径的三种策略：补充NAD+前体(NMN)、激活NAD+合成限速酶(NAMPT激动剂NAT)和抑制NAD+降解(CD38抑制剂78c)。78c可纠正NAD+/NADH比率，而NMN主要恢复ATP水平。

研究结论表明，几何约束驱动的人类运动组装体芯片平台为神经肌肉病理学研究提供了简单、高效且可靠的工具。IH通过靶向线粒体生物能量代谢，特别是破坏NAD+平衡，导致神经肌肉功能失调。该模型成功重现了呼吸系统疾病中观察到的肌肉病理表型，为临床前药物筛选和机制研究提供了有价值平台。针对NAD+代谢途径的干预策略显示出治疗IH相关神经肌肉并发症的潜力，为未来治疗发展指明了新方向。

该研究的重要意义在于首次在体外模型中直接证实了IH对人类神经肌肉系统的直接影响，揭示了运动神经元功能损伤先于结构改变的病理特征，为临床早期干预提供了理论依据。同时，提出的表面修饰工程方法简化了传统复杂制造工艺，提高了平台的可及性和稳定性，有望在多种实验室环境中广泛应用。