工程化外泌体递送KrasG12D特异性siRNA治疗胰腺癌的I期临床研究及免疫机制探索

本研究针对胰腺导管腺癌（PDAC）中KRASG12D突变靶向治疗难题，开发了搭载KrasG12D特异性siRNA的工程化外泌体（iExoKrasG12D）。通过I期临床试验证实其安全性及靶向 engagement，并发现其可重塑肿瘤免疫微环境，增强CD8+ T细胞浸润。临床前研究进一步揭示iExoKrasG12D与抗CTLA-4联用可协同抑制肿瘤，为PDAC的精准免疫联合治疗提供新策略。

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，患者中位生存期不足12个月，尽管现有化疗方案不断优化，但预后仍极差。超过90%的PDAC病例存在KRAS基因突变，其中KRAS^G12D突变占半数以上，成为驱动肿瘤发生和发展的关键分子事件。然而，由于KRAS蛋白的特殊结构，长期以来被认为“不可成药”，成为肿瘤治疗领域的重大挑战。近年来，尽管直接靶向KRAS的小分子抑制剂取得一定突破，但耐药性和治疗相关不良反应仍限制其临床应用。

针对这一困境，研究人员将目光投向了一种天然载体——外泌体。外泌体是细胞分泌的纳米级脂质双层囊泡，具有低免疫原性和良好的生物分布特性，可作为siRNA的理想递送系统。本研究团队先前在基因工程小鼠模型（GEM）中发现，靶向抑制Kras^G12D不仅可导致肿瘤消退，还能通过上调肿瘤细胞FAS死亡受体表达，促进CD8⁺ T细胞介导的肿瘤清除。这些发现为开发基于外泌体的精准治疗策略奠定了理论基础。

在此背景下，研究团队开展了名为iEXPLORE的首个人体临床试验，评估工程化外泌体搭载Kras^G12D特异性siRNA（iExoKras^G12D）在晚期PDAC患者中的安全性、耐受性和靶向作用。该研究采用单臂、剂量递增的I期临床试验设计，纳入经过多线治疗失败的转移性PDAC患者。令人鼓舞的是，iExoKras^G12D在所有剂量水平下均表现出良好的安全性，未出现剂量限制性毒性，最大耐受剂量未被达到。更重要的是，在部分患者中观察到疾病稳定，且肿瘤组织检测显示KRAS^G12DDNA下调、磷酸化ERK抑制以及CD8⁺ T细胞浸润增加。

为开展本研究，研究人员运用了几个关键技术方法：采用符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的外泌体生产工艺从健康供体骨髓间充质干细胞中提取外泌体；通过电穿孔法将Kras^G12D特异性siRNA装载入外泌体；使用纳米颗粒跟踪分析（NanoSight）和流式细胞术进行外泌体质控；利用低温电子显微镜（Cryo-EM）表征外泌体结构；建立临床级iExoKras^G12D的大规模生产工艺；开展小鼠和猕猴的临床前毒理学研究；采用3+3剂量递增和加速滴定设计进行I期临床试验；通过数字PCR检测循环肿瘤DNA中KRAS^G12D突变等位基因频率；运用多重免疫荧光染色分析肿瘤免疫微环境；使用染色质免疫沉淀（ChIP）分析表观遗传调控机制。

GMP grade exosomes for siRNA delivery showed no toxicity in preclinical studies

研究人员首先建立了符合GMP标准的外泌体生产工艺，从健康供体骨髓来源的间充质干细胞培养上清中提取外泌体，通过电穿孔法将Kras^G12D特异性siRNA装载入外泌体，形成iExoKras^G12D治疗产品。质量控制显示这些工程化外泌体大小分布均匀（平均尺寸<400纳米），表面表达CD47和CD63等外泌体标志物。在小鼠和猕猴中的临床前毒理学研究中，即使最高剂量（相当于临床剂量的4倍）也未观察到体重变化、器官重量改变或血液学参数异常。体内分布实验显示iExoKras^G12D在胰腺和肝脏中富集，证实了其靶向递送潜力。

Systemic iExoKrasG12D treatment showed no measurable toxicity in dose escalation clinical trial

I期临床试验采用3+3剂量递增设计，共纳入13例经多线治疗失败的转移性PDAC患者。患者接受每两周一个周期、共三个周期的iExoKras^G12D静脉输注。结果显示所有剂量水平（最高达4.8mg/剂）均未出现治疗相关不良事件，最大耐受剂量未被达到。3例患者达到疾病稳定，其中1例患者在完成6个周期治疗后维持疾病稳定达3个月。这些结果首次证实了异源外泌体在人体中的安全性和耐受性。

Systemic iExoKrasG12D treatment showed target engagement and remodeled tumor immune microenvironment

通过分析患者治疗前后样本，研究人员证实了iExoKras^G12D的靶向作用：循环肿瘤DNA中KRAS^G12D突变等位基因频率降低，肿瘤组织磷酸化ERK水平下降。同时，肿瘤免疫微环境发生重塑：CD8⁺ T细胞、CD4⁺ Foxp3⁺调节性T细胞和CD4⁺ Foxp3^- T细胞浸润增加。这些变化与临床前研究中观察到的现象一致，表明iExoKras^G12D不仅直接靶向癌基因，还间接调节抗肿瘤免疫反应。

CD8+ T cell recruitment and CD4+ T cells or Tregs depletion favored iExoKrasG12D therapy in preclinical models of PDAC

机制研究表明，iExoKras^G12D的治疗效果依赖于CD8⁺ T细胞。在基因工程小鼠模型中，CD8⁺ T细胞缺失完全消除了iExoKras^G12D的治疗 benefit，而CD4⁺ T细胞缺失则增强了治疗效果，提示CD4⁺ T细胞/调节性T细胞可能起抑制作用。进一步实验发现，iExoKras^G12D处理可诱导胰腺癌细胞重新表达FAS死亡受体，并通过表观遗传机制（降低DNA甲基转移酶DNMT1和组蛋白甲基转移酶EZH2在FAS启动子的富集，减少H3K27me3修饰）解除KRAS^G12D对FAS的转录抑制。

iExoKrasG12D efficacy relies on KrasG12D primed epigenetic regulation of Fas for Fas-FasL anti-tumor response by CD8+ T cells

研究发现iExoKras^G12D通过表观遗传调控机制解除KRAS^G12D对FAS死亡受体的抑制。染色质免疫沉淀分析显示，KRAS^G12D表达招募DNA甲基转移酶DNMT1和组蛋白甲基转移酶EZH2到FAS基因启动子区域，而iExoKras^G12D处理可抑制这种招募，降低H3K27三甲基化水平，增加H3K27乙酰化，从而激活FAS表达。这使得肿瘤细胞能够与CD8⁺ T细胞上的FAS配体相互作用，引发肿瘤细胞凋亡。

Clinical trial with iExoKrasG12D informed on preclinical combination therapy with immune checkpoint blockade

基于临床观察到的免疫微环境重塑，研究人员探索了iExoKras^G12D与免疫检查点抑制剂的联合治疗。在临床前模型中，iExoKras^G12D与抗CTLA-4抗体联合使用显示出显著的协同抗肿瘤效果，但与抗PD-1联合未观察到类似效应。进一步分析发现，联合治疗组肿瘤中形成三级淋巴结构（TLS），其中包含CD8⁺ T细胞、B细胞和内皮细胞，这种结构通常与更好的免疫治疗反应相关。

本研究首次在人体中验证了工程化外泌体靶向递送KRAS^G12D特异性siRNA的安全性和可行性，为靶向“不可成药”癌基因提供了新策略。研究不仅证实了iExoKras^G12D的靶向作用和免疫微环境重塑能力，还揭示了其通过表观遗传调控FAS表达促进CD8⁺ T细胞介导的肿瘤清除的机制。更重要的是，研究发现iExoKras^G12D与抗CTLA-4联合治疗的协同效应，为PDAC患者提供了新的精准免疫治疗组合方案。

这些发现具有重要的临床意义：首先，外泌体作为递送载体展现出的良好安全性为其进一步临床应用奠定了基础；其次，研究证实了靶向癌基因与免疫治疗结合的协同潜力；最后，研究揭示的FAS表观遗传调控机制为理解肿瘤免疫逃逸提供了新视角。尽管本研究仅为I期临床试验，但其取得的积极结果为后续更大规模的临床研究提供了有力支持，也为其他难治性肿瘤的靶向治疗提供了可借鉴的策略。

该研究于2025年发表在《Nature Communications》期刊上，由美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究团队完成。研究得到了癌症预防与研究所以及MD安德森Moon Shot计划的支持，体现了从基础机制发现到临床转化应用的全链条研究思路。