物种特异性PCR引物揭示路易斯安那州芦苇秆蚧寄生蜂空间分布与种间互作

本刊推荐：本研究针对入侵性害虫芦苇秆蚧（RCS）的生物防治需求，开发了三种寄生蜂（Neastymachus japonicus、Astymachus lasallei和Boucekiella depressa）的物种特异性多重PCR（multiplex PCR）引物体系。通过对比传统饲养鉴定与分子检测方法，证实PCR检测灵敏度提升2.2倍，首次揭示寄生蜂沿芦苇茎干的垂直分布规律及种间竞争现象（如多重寄生现象），为评估天敌昆虫控害潜力及生态位分化提供了关键技术支撑。

ABSTRACT

芦苇秆蚧（Nipponaclerda biwakoensis，简称RCS）是密西西比河三角洲地区芦苇（Phragmites australis）的重要害虫。在路易斯安那州东南部发现三种跳小蜂科（Encyrtidae）寄生蜂——日本新刺姬小蜂（Neastymachus japonicus）、拉氏显胚小蜂（Astymachus lasallei）和扁胸博氏小蜂（Boucekiella depressa）可寄生RCS，但其生物防治潜力尚未明确。本研究通过开发物种特异性PCR引物，实现快速准确的寄生率评估。具体目标包括：（1）测序三种寄生蜂的候选基因区域并开发多重PCR引物；（2）比较多重PCR与传统饲养及形态学鉴定的检测效果；（3）解析寄生蜂沿芦苇茎干的分布模式。结果表明，基于核糖体RNA D2区（28SD2）设计的引物可特异性扩增不同片段（B. depressa: 155 bp, N. japonicus: 221 bp, A. lasallei: 495 bp）。多重PCR检测使寄生蜂检出率提高2.2倍，且成功识别出传统方法遗漏的多重寄生组合。沿茎干垂直方向分析显示，寄生现象集中分布于茎基部0–100 cm区间，且不同蜂种呈现显著空间分化：A. lasallei与B. depressa的寄生频率随茎高增加而下降，而N. japonicus则呈上升趋势。本研究证实分子检测技术可显著提升寄生蜂监测效率，为评估本地寄生蜂种群对RCS的控害作用提供关键技术支持。

Introduction

芦苇秆蚧（RCS）原产于亚洲，是芦苇植株的刺吸性害虫，近年来在路易斯安那州入侵成灾。密西西比河三角洲（MRD）的芦苇群落对维持湿地生态稳定性具有重要作用，但RCS的暴发严重威胁其生存。传统防治方法（如焚烧、刈割或化学农药）因实施难度大、成本高而受限，因此生物防治成为潜在解决方案。跳小蜂科昆虫是蚧类害虫的重要天敌，其中B. depressa、A. lasallei和N. japonicus在路易斯安那州野外均被发现可寄生RCS。然而，这些蜂种的生物学特性、分布格局及种间互作（如多重寄生和超寄生）仍不明确。准确鉴定寄生蜂幼虫是研究其生态互作的关键，但传统依赖成虫羽化的方法受限于低羽化率及形态鉴定难度。物种特异性PCR引物可从宿主昆虫中直接检测未成熟寄生蜂DNA，显著提升检测效率。本研究选取线粒体COI基因、28S rRNA D2区（28SD2）和ITS2区域作为候选靶标，开发多重PCR引物体系，以解析三种寄生蜂的空间分布及竞争关系。

Materials and methods

Field collection of P. australis stems infested with RCS

2019年6月从路易斯安那州东南部三个地点（Manchac、Cut Off和Leeville）采集45根芦苇茎干。每根茎干按50 cm分段，剥离叶鞘后统计若虫、成熟雌蚧及被寄生蚧的数量。采用Wilcoxon非参数检验比较不同茎段的蚧虫密度，并利用广义线性混合模型（GLMM）分析蜂种检测方法与茎高的关系。

Rearing RCS parasitoids and identification via morphological characteristics

将被寄生蚧个体隔离于凝胶胶囊中，在26°C、60–80% RH条件下饲养至成虫羽化（最长60天）。成虫依据体色、触角形态、刚毛特征等形态指标鉴定种类，并参考Noyes等人提供的分类键进行确认。

DNA extraction and PCR protocol for molecular identification of RCS parasitoids

使用Qiagen DNeasy?试剂盒提取寄生蜂及RCS基因组DNA，通过Qubit?荧光计定量。PCR反应采用GoTaqGreen?或DreamTaq?预混体系，引物浓度10 μM，退火温度经梯度PCR优化确定为55–58°C。扩增产物经1.5–2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，SYBR? Safe染色显带。

Sequencing, DNA editing, and assembly

PCR产物送Eurofins Genomics纯化并测序（ABI 3730xl测序仪）。使用GeneStudio?软件编辑序列，并通过NCBI BLAST比对已公布的跳小蜂序列以验证特异性。

Species-specific primer development

基于28SD2区序列设计物种特异性引物（表2）。通过比对同种个体序列保守区及种间高变区，确保引物特异性。最终筛选出的引物可分别扩增三种蜂种的特异性片段，且可通过多重PCR在同一反应中区分不同蜂种。

Statistical analysis

使用JMP? 16.2.0进行非参数检验分析蚧虫密度分布，R 4.0.5软件构建GLMM模型评估检测方法、茎高及采集地点对蜂种检出频率的影响。

Results

Primer development and testing

28SD2区域在种内保守、种间变异度高，适于引物设计。梯度PCR确定多重PCR最佳退火温度为55–58°C。特异性验证显示各引物仅扩增目标蜂种DNA，且多重寄生样本可同时呈现多条条带（图S4）。序列已提交GenBank（表3）。

Parasitoid species identification methods

分子检测成功率为68.4%，显著高于饲养方法的30.3%（图1）。多重寄生现象在PCR检测中检出率提高2.5倍，共发现13组多重寄生组合（表4），而饲养法仅检出10组A. lasallei–B. depressa组合。

Scale and parasitoid presence along stem length

茎干平均高度181.1 cm，若虫密度（129.21头/茎）显著高于被寄生蚧（9.89头/茎）。200 cm以上茎段仅见若虫，寄生现象集中分布于0–100 cm区间（图2）。GLMM分析表明，A. lasallei和B. depressa的寄生频率随茎高增加而显著下降（p < 0.05），N. japonicus则呈上升趋势（p < 0.05）。PCR法对N. japonicus的检出率比饲养法高4.6倍，且其频率随茎高变化的趋势在两种方法间存在显著交互作用（p = 0.008）。采集地点对蜂种分布无显著影响。

Discussion

本研究开发的多重PCR引物体系可高效鉴别三种RCS寄生蜂，并显著提升检测灵敏度。分子检测避免了传统饲养中因样本损伤、脱水或种间竞争导致的漏检问题，尤其适用于N. japonicus等易受竞争抑制的蜂种。沿茎干垂直方向的分布差异提示蜂种可能存在生态位分化：A. lasallei与B. depressa偏好基部成熟蚧群，而N. japonicus可能倾向于寄生上部年轻若虫。B. depressa疑似具备超寄生能力，其与A. lasallei的多重寄生组合最常见，未来需通过幼虫DNA检测进一步验证。本研究为评估寄生蜂种群动态、种间互作及生物防治潜力提供了关键技术工具，后续应拓展至其他州RCS种群及本地蚧虫天敌互作研究。