基于基因组突变RNA定位技术(GMRM)克隆小麦抗条锈病基因Yr6并揭示其NLR蛋白对作用机制

本研究针对小麦条锈病抗性基因克隆难题，开发了基因组突变RNA定位(GMRM)技术，成功从小麦品种CDC_Stanley中克隆到由头对头排列的NLR蛋白对(Yr6NLR1/Yr6NLR2)构成的Yr6基因，揭示了其通过直接互作形成异源复合体介导抗性的分子机制，为小麦抗病育种提供了新基因资源和高效克隆策略。

　　

小麦作为全球最重要的粮食作物之一，养活了世界上三分之一的人口，在中国更有40%的人口以小麦为主食。然而，由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici, Pst)引起的小麦条锈病严重威胁着全球小麦生产。挖掘和利用条锈病抗性(Yr)基因是防治该病害最经济环保的策略。但由于普通小麦基因组庞大且重复序列多，利用传统正向遗传学方法克隆小麦抗病(R)基因极为困难。

近年来，通过整合甲基磺酸乙酯(EMS)诱变和简化基因组测序技术，研究人员开发了MutChromSeq、MutRenSeq、MutIsoSeq和STAM等基因克隆方法，加速了小麦抗病基因的克隆进程。目前，国际正式命名的Yr基因位点有87个，另有300多个数量抗性位点(QTLs)，但仅有11个Yr基因被成功克隆，包括Yr5/YrSp、Yr7、Yr10/YrNAM、Yr15、Yr18/Lr34/Sr57/Ltn1、Yr27、Yr28、Yr36、Yr46/Lr67/Sr55/Ltn2、YrAS2388R和YrU1等。其中六个编码典型的核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列(NLR)蛋白，两个编码激酶融合蛋白，两个编码多药和有毒化合物外排转运蛋白，一个编码含有NAM和ZnF-BED结构域的蛋白。

在这项发表于《Plant Communications》的研究中，研究人员开发了一种名为基于基因组突变RNA定位(Genome-based mutant RNA mapping, GMRM)的新方法，成功从小麦品种CDC_Stanley中克隆了Yr6基因，并揭示Yr6介导的抗性是由一对头对头排列的NLR蛋白(Yr6NLR1和Yr6NLR2)共同控制的。这项研究与另一篇同时报道从中国优良小麦品种矮抗58中克隆Yr6的研究相互印证。

主要技术方法

研究团队对小麦品种CDC_Stanley进行EMS诱变，构建了约1,400个M2家系的突变体群体，通过接种条锈菌生理小种CYR34(V26)筛选获得54个丧失抗性的突变体。选取10个突变体进行Pst感染叶片的转录组测序，平均每个样本产生164.9百万条150-bp双端测序 reads。利用开发的GMRM分析流程，将RNA-Seq reads映射到CDC_Stanley基因组，通过滑动窗口分析寻找多个突变体共有的EMS型(G/C to A/T)突变区域，最终定位到7B染色体长臂上一个50kb的区段。

Yr6基因的鉴定与功能验证

通过GMRM分析，研究人员在7B染色体长臂上一个50kb区段(LR865758.1_707445000)发现了一个在所有10个丧失抗性突变体中均存在EMS型突变的位置。该区段包含两个头对头排列的NLR编码基因TraesSTA7B03G04243600和TraesSTA7B03G04243610。六个突变体在TraesSTA7B03G04243600中携带突变，另外四个在TraesSTA7B03G04243610中携带突变。所有突变都导致两个NLR蛋白的氨基酸替换、提前终止密码子或异常RNA剪接。

通过对剩余44个丧失抗性突变体的Sanger测序，发现19个在TraesSTA7B03G04243600中存在非同义突变，17个在TraesSTA7B03G04243610中存在非同义突变。将分别携带TraesSTA7B03G04243610和TraesSTA7B03G04243600突变的M3和M7突变体进行杂交，产生的F1植株表现出对Pst CYR34(V26)的抗性，而M3和M7亲本则感病。这两个头对头排列的基因共享1,276bp的调控序列，且均受Pst感染诱导表达，表明TraesSTA7B03G04243600和TraesSTA7B03G04243610都是抵抗Pst CYR34(V26)所必需的。

研究人员通过基因组比对发现，小麦品种Cadenza和Yr6近等基因系AvocetYr6也都携带与CDC_Stanley相同的NLR对。Cadenza和AvocetYr6对Pst CYR34(V26)表现抗性，而Avocet S感病。通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术在CDC_Stanley和AvocetYr6中沉默任一个NLR基因，均导致对CYR34(V26)的感病性增加，证实了这对NLR蛋白的功能及其作为Yr6基因的身份。TraesSTA7B03G04243600和TraesSTA7B03G04243610分别被命名为Yr6NLR1和Yr6NLR2。

Yr6NLR1和Yr6NLR2的蛋白结构与互作机制

利用AlphaFold 3预测Yr6NLR1和Yr6NLR2的三维结构并结合InterPro的预测结果，Yr6NLR1蛋白模型包含N端卷曲螺旋(CC)结构域、核苷酸结合和寡聚化(NBS)结构域以及C端富含亮氨酸重复(LRR)结构域，其后还有一个115个氨基酸的内在无序区(IDR)；而Yr6NLR2模型则拥有N端CC结构域、截短的NBS结构域和C端LRR结构域。

研究人员使用AlphaFold 3预测了两个NLR蛋白之间的相互作用，ipTM得分为0.79，表明预测的接口具有高置信度，pTM得分为0.78，提示蛋白模型与参考结构相比具有合理的准确性。通过原生质体共免疫沉淀(Co-IP)实验、分裂萤火虫荧光素酶互补(SFLC) assay和双分子荧光互补(BiFC) assay，在烟草叶片中实验验证了Yr6NLR1和Yr6NLR2之间的直接物理相互作用，证明它们可能通过直接互作形成异源复合体。

Yr6与Pm5e的等位基因关系

Yr6与白粉病抗性基因Pm5e/RXL是等位基因，最初被克隆为单例NLR基因，最近被确认为NLR对。典型的NLR对包含一个带有整合结构域(IDs)的传感器NLR(负责感知病原体效应子)和一个执行器NLR(负责启动免疫信号)。Yr6NLR1与Pm5e的序列同一性为94%，而Yr6NLR2与RXL的序列同一性高达99.4%。研究还发现小麦品种Fielder携带与CDC_Stanley相同的Yr6序列，并确认其对Pst小种CYR34(V26)的抗性。Fielder中的RXL等位基因(即Yr6NLR2)可以与Pm5e配对赋予对白粉病的抗性，这支持了Yr6NLR2和RXL可能作为执行器NLR，而Yr6NLR1和Pm5e作为传感器NLR的结论。

GMRM技术的优势

GMRM技术能够同时克隆两个功能互补的基因。就Yr6而言，两个因果基因在遗传上是连锁的，但基因克隆过程不涉及任何遗传重组。因此，理论上该方法可用于同时克隆多个功能互补的基因(参与同一通路的基因)，只要这些基因能够被EMS诱变靶向。与MutChromSeq、MutRenSeq、MutIsoSeq和STAM等其他方法相比，GMRM具有不需要初始染色体定位、不限于NLR基因克隆、使用基因组参考避免转录本异构体复杂性等优势。分析表明，GMRM在检测因果EMS突变方面的覆盖度比MutIsoSeq平均提高53%，并且能够识别剪接位点突变，这是MutIsoSeq或STAM无法检测到的突变类型。

研究结论与意义

本研究成功开发了GMRM技术，并利用该技术从小麦品种CDC_Stanley中克隆了由一对头对头排列的NLR蛋白(Yr6NLR1和Yr6NLR2)构成的Yr6基因。研究发现这两个NLR蛋白通过直接相互作用形成异源复合体来介导对条锈病的抗性。Yr6与白粉病抗性基因Pm5e/RXL是等位基因，Yr6NLR1/Pm5e可能作为传感器NLR，通过其整合的IDR结构域感知不同病原体的效应子，而Yr6NLR2/RXL作为执行器NLR激活防御反应。

这项研究不仅克隆了一个重要的小麦抗病基因，还开发了一种高效的基因克隆技术GMRM，为小麦和其他作物的抗病基因挖掘提供了有力工具。Yr6/Pm5代表了能够抵抗两种不同病原体的等位基因的又一个例子，为未来工程化NLR以实现多病原体识别特异性提供了重要资源。随着下一代测序(NGS)成本的下降和植物泛基因组测序的进展，GMRM将进一步加速抗病性或其他性状的基因挖掘，为未来分子设计育种提供基因资源。