小麦Yr6位点与Pm5等位并携带NLR基因对赋予条锈病抗性

本研究针对小麦条锈病抗性基因多样性不足、病原菌易变异导致抗性丧失的产业难题，研究人员通过图位克隆、EMS诱变和基因功能验证，发现Yr6位点实际上由一个头对头排列的NLR基因对(Yr6RL/Yr6CNLI)协同作用，共同赋予对条锈菌的抗性。该基因对与抗白粉病基因Pm5等位，揭示了小麦通过NLR基因对机制实现对多种真菌病害的抗性，为小麦抗病育种提供了新的基因资源和理论依据。

　　

小麦作为全球最重要的粮食作物之一，其生产一直受到多种病害的威胁。其中，由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici, Pst)引起的小麦条锈病是最具破坏性的真菌病害之一，严重发生时可导致作物减产40%以上甚至绝收。培育和种植抗病品种是防治条锈病最经济有效的措施，然而由于小麦抗病基因(Yr基因)多样性不足，条锈菌群体频繁变异产生新的毒性小种，往往在抗病品种推广数年后就丧失抗性，导致病害再度流行。

尽管国际小麦基因命名委员会已正式命名了87个Yr基因和300多个数量性状位点(QTL)，但仅有约3%(11个)被成功克隆，这严重限制了基于基因信息的抗病育种策略的精准设计。已克隆的抗病基因主要编码两类蛋白：核苷酸结合富亮氨酸重复序列(NLR)蛋白和激酶融合蛋白(KFP)。典型的NLR蛋白通常以单体形式识别病原菌并通过寡聚化形成抗病小体(resistosme)启动免疫反应，但近年研究发现一些NLR基因以"传感(sensor)-执行(executor)"或"传感-辅助(helper)"配对形式发挥作用，这类配对基因很少发生重组，其中传感NLR识别病原菌无毒(Avr)蛋白，而执行NLR则激活后续免疫信号传导。然而，关于配对NLR如何在小麦中介导病害抗性一直知之甚少，直到最近关于Pm5e^RXL-Pm5e^NLR基因对的研究才取得实质性进展。

在此背景下，西北农林科技大学吴建辉教授团队在《Plant Communications》上发表了关于小麦Yr6抗条锈病基因的研究成果。研究人员利用我国主栽小麦品种矮抗58(AK58)的EMS诱变群体，结合图位克隆、病毒诱导基因沉默(VIGS)、遗传转化、蛋白互作检测和进化分析等多种技术手段，系统解析了Yr6介导的抗条锈病机制。

研究团队首先通过图位克隆将Yr6定位在7BL染色体上，初步确定TraesAK58CH7B01G485100(编码一个包含卷曲螺旋(CC)样结构域、核苷酸结合域(NB)、富亮氨酸重复序列(LRR)和内在无序区域(IDR)的非典型NLR蛋白，命名为Yr6^CNLI)为候选基因。然而，在对2927个M2和1089个M3代EMS诱变植株进行接种鉴定获得的9个感病突变体进行测序分析时，发现其中4个突变体在Yr6^CNLI基因中存在错义突变，而另外5个突变体则在相邻的TraesAK58CH7B01G485000基因中存在非同义突变。该基因编码一个包含Rx_N结构域、截短的NB-ARC结构域(tNB)和LRR结构域的蛋白，命名为Yr6^RL，与Yr6^CNLI形成头对头排列结构，起始密码子相距1276 bp。

Yr6^RL和Yr6^CNLI协同介导Yr6依赖的条锈病抗性

通过BSMV介导的基因沉默技术瞬时沉默Yr6^RL后，AK58对条锈菌小种V26L由抗病变为感病，表明Yr6^RL同样参与条锈病抗性。RT-qPCR分析显示Yr6^RL和Yr6^CNLI在AK58中具有相似的表达模式，且均受条锈菌诱导表达。为进一步验证这两个基因的功能，研究团队将Yr6^RL、Yr6^CNLI以及两者同时转入感病品种扬麦18(YM18)中。结果显示，单独过表达Yr6^RL或Yr6^CNLI的转基因株系仍感病，而共过表达两个基因的株系则表现抗病，表明Yr6^CNLI和Yr6^RL可能作为NLR基因对共同介导Yr6依赖的条锈病抗性。

Yr6^CNLI和Yr6^RL在植物细胞内形成异源复合物

亚细胞定位分析发现Yr6^CNLI-GFP和Yr6^RL-GFP均定位于质膜、细胞核和细胞质中，且共表达Yr6^CNLI-GFP和Yr6^RL-mCherry显示两者共定位。通过AlphaFold3预测三维结构并进行分子对接，发现Yr6^CNLI的NB结构域与Yr6^RL的Rx_N结构域之间，以及Yr6^CNLI的LRR结构域与Yr6^RL的LRR结构域之间存在结合亲和力。异源Yr6^CNLI-Yr6^RL复合物的相互作用评分显著高于同源复合物，表明这两个蛋白优先形成异源复合物。分裂荧光素酶互补(SLC)实验、双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)实验均证实Yr6^CNLI和Yr6^RL在植物体内存在相互作用，主要发生在细胞核和细胞质中。进一步通过酵母双杂交和SLC实验分析结构域互作，发现Yr6^RL的Rx_N和tNB结构域与Yr6^CNLI的CC结构域相互作用，同源复合物形成主要依赖于Yr6^CNLI中的CC-CC相互作用，以及Yr6^RL中的Rx_N-Rx_N和tNB-tNB相互作用，表明CC/Rx_N结构域在Yr6^CNLI和Yr6^RL的异源复合物形成中起关键作用。

Yr6基因对与Pm5基因的等位关系及进化起源

研究发现AK58中的Yr6^CNLI-Yr6^RL与最近报道的抗白粉病基因Pm5e^RXL-Pm5e^CNL(源自品种阜麦30)是等位基因，表明Yr6基因对进化出了识别多种真菌病原菌的能力。系统进化分析表明，这种配对的NLR系统特异存在于单子叶植物中，Yr6^CNLI(可能作为传感NLR)在大多数单子叶植物中保持了结构域的完整性，而只有少数物种保持了完整的Yr6^RL结构。随着小麦族的进化，携带NB-ARC和LRR结构域的祖先Yr6^RL逐渐丢失了大部分结构域，仅保留LRR结构域，呈现出"辅助"特征。Yr6^RL具有截短的NB-ARC结构域，导致MHD基序缺失，无法调节NLR蛋白的活性。研究人员在16个野生和栽培小麦族物种(包括60个公开的小麦基因组)中鉴定了Yr6同源基因，系统进化分析将50个同源基因(包括Pm5a、Pm5b、Pm5e、Pm5ND和Yr6)根据序列相似性分为14个不同的簇。有趣的是，Pm基因的主要进化枝与四倍体圆锥小麦(T. turgidum)品种Svevo紧密聚在一起，表明可能起源于该物种；而Yr基因的主要进化枝与Timopheevii小麦(T. timopheevii)亲缘关系更近，表明可能来自外源基因渗入。Yr6^CNLI比Yr6^RL表现出更高的遗传多样性，表明传感NLR的变异受到强烈的正选择，这可能由宿主-病原菌互作驱动。随着六倍体小麦的驯化，Yr6^CNLI在Pm和Yr谱系中的核酸多样性进一步增加。选择变异主要发生在Pm的IDR区域和Yr的NB-ARC结构域，这些变异与各自的抗病性显著相关。

本研究通过EMS诱变、基因沉默和遗传转化证实Yr6^CNLI和Yr6^RL在基因组上相邻且协同作用赋予条锈病抗性。遗传和分子数据表明，与其他配对NLR类似，Yr6^CNLI和Yr6^RL形成异源复合体，共同在条锈病抗性中发挥作用。一些Yr6^RL或Yr6^CNLI表达水平较低的植株表现出感病症状，表明只有当两个基因的表达水平和/或丰度达到一定阈值时才能赋予完全抗性。研究还为广谱抗性育种提供了见解，表明对两种不同真菌病害具有抗性的Yr6和Pm5是同一个R基因座的不同单倍型，两种抗性功能都依赖于这种配对的NLR系统。Yr6/Pm5的进化轨迹表明，Pm基因起源于四倍体祖先，而Yr基因可能来自外源渗入。尽管都对活体营养型病害具有抗性，但Yr6/Pm5进化出了两个不同的病原菌识别域，一个在IDR区域，另一个在NB和CC结构域。此外，建议将提供小种特异性抗性的Yr6与成株抗性基因(如Yr29、Yr30和YrZH22)结合使用。这种基因堆叠应在西北地区使用，但应避免在西南地区使用。研究结果为利用配对NLR控制小麦多种病害提供了遗传、分子和进化指导。