伪狂犬病毒DNA聚合酶持续合成因子pUL42通过靶向cGAS（第161-353位氨基酸）抑制DNA识别与寡聚化负向调控I型干扰素产生的机制研究

本研究首次揭示伪狂犬病毒（PRV）编码的DNA聚合酶持续合成因子pUL42通过直接结合宿主cGAS的DNA结合域（第1-160位氨基酸），抑制其对病毒双链DNA（dsDNA）的识别能力，进而阻断cGAS二聚化/寡聚化及下游cGAMP-STING-TBK1-IRF3信号通路活化，最终抑制I型干扰素（IFN-I）产生并促进病毒复制。该发现为PRV免疫逃逸机制提供了新视角，对开发新型抗PRV药物具有重要理论意义。

　　

ABSTRACT

伪狂犬病（Pseudorabies, PR）由伪狂犬病毒（PRV）引起，是一种急性传染性疾病。本研究首次系统阐明PRV编码的pUL42蛋白通过靶向cGAS-STING信号通路抑制I型干扰素（type I IFN）产生的分子机制。实验证实pUL42直接与cGAS的DNA结合域相互作用，抑制其对双链DNA（dsDNA）的识别能力，进而阻断cGAS二聚化与寡聚化激活过程。通过siRNA敲低Ul42基因表达可显著增强PRV感染诱导的IFN-β产生并抑制病毒复制。这些发现揭示了PRV通过pUL42靶向cGAS介导的信号通路实现免疫逃逸的新策略。

INTRODUCTION

天然免疫系统是宿主抵御病原体入侵的第一道防线。cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）作为关键的模式识别受体，可识别细胞质中的病毒双链DNA并催化合成第二信使cGAMP，进而激活STING-TBK1-IRF3信号轴，诱导I型干扰素产生。PRV属于α疱疹病毒科，可感染多种哺乳动物并引起严重神经系统症状。尽管已知PRV通过多种蛋白（如pUS2、pUL13、EP0）拮抗宿主免疫应答，但其靶向cGAS-STING轴的具体机制尚未明确。pUL42作为DNA聚合酶持续合成因子，在病毒复制中起关键作用，近期研究发现其可通过上调SOCS1诱导p65泛素化降解，或通过结合干扰素刺激反应元件（ISRE）抑制ISGF3转录活性。然而，pUL42是否调控cGAS-STING信号通路仍属未知。

RESULTS

PRV pUL42抑制cGAS-STING信号通路

通过系统性筛选44个PRV编码蛋白对IFN-β启动子活性的影响，发现pUL24、pUL42和pUL32具有显著抑制作用。进一步验证表明，pUL42可剂量依赖性抑制cGAS-STING诱导的IFN-β、ISG56、ISG54、ISRE和NF-κB启动子活性。在HeLa细胞中，pUL42过表达显著降低poly(dA:dT)刺激或cGAS-STING过表达引起的Ifnb1、Isg56和Isg54 mRNA水平。Western blot分析证实pUL42抑制poly(dA:dT)诱导的TBK1（Ser172）和IRF3（Ser396）磷酸化。

敲低Ul42表达促进PRV诱导的I型干扰素产生

由于Ul42基因缺失会导致PRV无法复制，研究采用siRNA敲低策略。转染靶向Ul42的siRNA（si520）后，猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和HeLa细胞感染PRV时显示Ifnb1和Isg56 mRNA水平显著升高，病毒滴度下降约2个对数单位。同时，Ul42敲低促进PRV感染诱导的TBK1和IRF3磷酸化，并抑制病毒蛋白gB、gE和EP0的表达。

PRV pUL42与cGAS相互作用

免疫共沉淀实验证实pUL42与cGAS直接结合，但不与STING、TBK1或IRF3结合。内源性cGAS在PRV感染的PAMs中与pUL42发生相互作用。细胞定位分析显示pUL42在PRV感染后8-24小时存在于细胞质，并与cGAS共定位（Pearson系数约0.8）。通过构建cGAS截断体，发现其N端DNA结合域（第1-160位氨基酸）是与pUL42互作的关键区域。pUL42的第116-353位氨基酸是其与cGAS结合并抑制IFN-β产生的功能域。核定位信号（NLS）缺失突变体（pUL42-ΔNLS）完全定位于细胞质后仍保留部分抑制功能，表明pUL42主要在细胞质中发挥抑制作用。

pUL42的DNA结合位点是其抑制功能的关键

序列比对发现PRV pUL42的Lys124、Arg196、Gln279和Arg280与HSV-1 pUL42的四个保守精氨酸残基对应。构建这些位点的突变体后，四突变体（pUL42-4M）完全丧失与cGAS的结合能力，且无法抑制cGAS-STING诱导的IFN-β启动子活性和Ifnb1 mRNA表达。同时，pUL42-4M失去对poly(dA:dT)诱导的TBK1/IRF3磷酸化和cGAMP产生的抑制能力。

pUL42抑制cGAS与DNA结合及寡聚化

DNA pull-down实验显示pUL42通过其DNA结合位点直接与PRV基因组DNA结合，并显著抑制cGAS与生物素标记的PRV DNA或poly(dA:dT)结合。在PRV感染细胞中敲低pUL42可恢复cGAS与病毒DNA的结合能力。此外，pUL42过表达抑制cGAS二聚化，而pUL42-4M无此效应。非变性凝胶电泳证实pUL42抑制poly(dA:dT)诱导的cGAS寡聚化，Ul42敲低则逆转PRV感染对cGAS寡聚化的抑制。

pUL42通过靶向cGAS介导的信号通路促进PRV复制

在野生型PK15（PK15-WT）和cGAS敲除（PK15-cGAS^-/-）细胞中敲低Ul42表达，发现仅在PK15-WT细胞中Ul42敲低显著增强PRV诱导的Ifnb1 mRNA表达和IFN-β分泌，病毒滴度下降2个对数单位；而在PK15-cGAS^-/-细胞中病毒滴度仅下降1个对数单位，且IFN-β产生无变化。这表明pUL42主要通过靶向cGAS信号通路促进病毒复制。

DISCUSSION

本研究首次揭示PRV pUL42通过直接结合cGAS的DNA结合域，竞争性抑制其与病毒DNA的识别，进而阻断cGAS二聚化/寡聚化及后续cGAMP合成，最终抑制I型干扰素产生。该机制与已知的PRV免疫逃逸策略（如pUL13降解STING、pUL24降解IRF7）形成互补，凸显了疱疹病毒多层面抑制宿主免疫应答的特点。pUL42在病毒复制与免疫调节中的双重功能使其成为抗PRV药物开发的潜在靶点。研究结果为设计新型减毒活疫苗提供了理论依据。

MATERIALS AND METHODS

实验采用PK15、HEK293T、HeLa细胞及原代猪肺泡巨噬细胞。PRV-JM毒株分离自广东江门临床样本。通过免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因、qPCR、Western blot、免疫荧光、DNA pull-down等技术验证分子互作与信号通路调控。siRNA敲低采用HiPerFect转染试剂，统计分析使用SPSS 16.0软件。