发现坦布苏病毒NS5蛋白拮抗I型干扰素信号通路的新功能区域——一个独特的核定位信号（NLS37–45）的鉴定与机制研究

本研究揭示了坦布苏病毒（TMUV）通过其NS5蛋白拮抗宿主I型干扰素（IFN-I）信号通路的新型机制，鉴定出N端37–45位氨基酸构成的功能性核定位信号（NLS），该区域与核转运蛋白（KPNAs）互作，干扰STATs核转位，从而抑制干扰素刺激基因（ISGs）表达。研究不仅深化了对黄病毒属（Flavivirus）免疫逃逸策略的理解，还为抗病毒治疗提供了新的潜在靶点。

　　

摘要

黄病毒属（Flavivirus）的多种成员对公共卫生构成严重威胁，它们多数已进化出对抗I型干扰素（IFN-I）的抗病毒活性的逃逸策略，使得预防和控制充满挑战。本研究揭示，主要感染鸭并引发严重疾病的坦布苏病毒（TMUV）能通过其NS5蛋白抑制IFN-I信号通路，有效阻止IFN激活的转录因子STATs的核转位，并显著削弱干扰素刺激基因（ISGs）的转录诱导。有趣的是，研究发现TMUV-NS5的N端37–45位氨基酸（aa）残基构成一个功能性核定位信号（NLS），与核转运蛋白（karyopherins）互作，从而破坏核转运系统，这与大多数黄病毒中发现的经典α/β NLS形成对比。通过深入分析，研究强调NLS的核转运能力受多种因素调节，如货物蛋白的种类和分子大小，这为理解黄病毒NS5差异亚细胞定位提供了关键的机制见解。总之，这些发现有助于更好地理解TMUV-NS5如何抑制IFN-I信号通路，并为黄病毒逃逸先天免疫应答提供了新的视角。

引言

坦布苏病毒（TMUV）是一种有包膜、正义单链RNA病毒，是主要感染产蛋鸭的传染性病原体，自2010年以来在中国造成了巨大的经济损失。它属于黄病毒属，该属除TMUV外，还包括70多个成员，如登革病毒（DENV）、西尼罗河病毒（WNV）、日本脑炎病毒（JEV）、黄热病病毒（YFV）和寨卡病毒（ZIKV）。该组病毒多数是人畜共患病原体，可引发严重的人类和动物疾病。迄今为止，TMUV primarily responsible for severe egg drop syndrome，已逐渐扩大其宿主范围 beyond ducks，鸡和鹅也易感。此外，在鸭业 workers 中检测到高血清TMUV抗体阳性率，表明该病毒对公共卫生构成潜在威胁。

黄病毒有一个约11 kb的基因组，编码 only one open reading frame (ORF)。通过宿主和病毒蛋白酶 cleavage 产生三种结构蛋白：核心（C）、膜（prM）和包膜（E），以及七种非结构（NS）蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。C、prM和E蛋白是病毒粒子形成所必需的，而NS蛋白参与在内质网膜上建立位点（称为病毒复制复合物），病毒RNA复制在此发生。在NS蛋白中，黄病毒NS5蛋白是最大且最保守的，其N端包含一个甲基转移酶（MTase）结构域，而C端具有RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性。

干扰素（IFN）介导的先天免疫是抵御入侵病毒的第一道防线，在启动适应性免疫应答中起关键作用。I型IFN（IFN-I）（α/β）是响应病毒和其他微生物感染的主要效应细胞因子。它通过Janus激酶信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号通路调节数百种基因产物。分泌后，IFN-I首先与细胞表面的IFN α/β受体（由两个亚基IFNAR1和IFNAR2组成）相互作用，随后激活的Janus激酶1（JAK1）和酪氨酸激酶2（Tyk2）导致信号转导和转录激活因子（STAT1和STAT2）在酪氨酸残基处磷酸化。STATs是JAK-STAT信号通路中的关键参与者，它们与转录因子IFN调节因子9（IRF9）组成性相互作用，形成称为IFN刺激基因因子3（ISGF3）的转录因子复合物，作为细胞表面和细胞核之间的关键连接。此类大蛋白（通常超过40 kDa）的核质转运过程总是需要输入蛋白karyopherin α或β的参与。IFN刺激后，输入α家族的特定成员importin α5（KPNA1）识别pSTAT1的条件性核定位信号（NLS），无论是ISGF3形式还是同源二聚体形式，然后与importin β1（KPNB1）相互作用，介导复合物传递入核。随后，这些信号继续诱导ISGs的表达，这些基因负责建立抗病毒状态并破坏病毒生命周期的各个阶段。

为了在宿主中建立感染和复制，多种黄病毒进化出了强大的策略来对抗IFN-I的诱导和信号传导，它们的NS蛋白 consistently play pivotal roles in this inhibition。最近的研究确定TMUV NS1和NS2B3蛋白可以抑制IFN-β的诱导，表明它与大多数黄病毒一样是一种免疫抑制病毒。值得注意的是，在NS蛋白中，NS5已知在先天免疫逃逸中很重要，其多种作用已在IFN-I信号通路的拮抗中被鉴定，包括降低STATs的表达或磷酸化水平、减少ISGF3的形成以及抑制STATs在核内的积累。然而，TMUV是否也拮抗IFN-I信号传导以及哪种蛋白主要介导这种抑制仍有待确定。

本文证明TMUV-NS5蛋白是感染后IFN-I信号通路的主要抑制剂，并通过其N端的功能性NLS_37–45与KPNAs相互作用，从而干扰STATs的核积累。这些发现为TMUV逃逸先天免疫应答的能力提供了新的见解，并确定了其预防和控制的潜在靶区域。

结果

TMUV拮抗IFN-I信号传导

IFN-I系统通常有效防御黄病毒感染，但一些病原体获得了 specific mechanisms to limit this response。为检查IFN-I对TMUV的影响，用TMUV（感染复数[MOI] = 1）感染HEK293细胞24小时，然后用IFN-α（50和500 U/mL）刺激12小时。使用间接免疫荧光 assay（IFA）和 western blot（WB）分析，发现TMUV感染未受IFN-α处理的显著影响。接下来 confirmed that pre-infection treatment of these cells with IFN-α inhibited the replication of TMUV, but that the antiviral effect was less robust if it was added to the cells following infection。此外，mock-和TMUV感染的HEK293细胞用IFN-α（500 U/mL）刺激12小时，然后接种水泡性口炎病毒（VSV）24小时。IFA显示IFN-α可显著减少VSV感染，但在TMUV感染的细胞中，其功能有限，VSV复制恢复。这些结果表明TMUV感染后，IFN-α的抗病毒效果未有效发挥。

IFN与IFNARs结合并通过JAK-STAT通路传递信号，导致含有IFN刺激应答元件（ISRE）的启动子的抗病毒基因激活。为进一步研究TMUV对IFN-α诱导的ISRE激活的影响，将HEK293细胞与荧光素酶报告构建体（pISRE-TA-luc）和pRL-SV40共转染，然后用TMUV（MOI = 0.2, 1）感染24小时。经IFN-α处理6小时后，ISRE启动子活性比对照细胞（无TMUV和IFN-α）高约45倍。然而，在TMUV感染的细胞中，其水平显著降低，刺激12小时后获得类似结果。此外，还分析了ISGs的mRNA表达，它们是抵抗病毒感染的主要执行者。用TMUV（MOI = 0.2）接种并用500 U/mL IFN-α处理12或24小时后，通过qRT-PCR测量代表性ISGs（ISG15、ISG56、Mx1和OAS1）的表达。IFN-α刺激后，ISGs的转录本比正常对照（无TMUV感染和IFN-α处理）分别增加62倍、452倍、6倍和10倍，但这些检测的mRNA水平在TMUV感染后显著降低。尽管这些ISG水平高于单独病毒感染，但与mock感染的细胞（有IFN-α处理）相比，它们被显著抑制，未能有效 prevent further viral infection。当感染剂量增加（MOI = 1）时，TMUV对ISGs的抑制 effects still existed。总之，这些观察 strongly suggested that TMUV could impair the immune response via decreasing ISG expression and, like other flaviviruses (such as DENV and LGTV), must encode the antagonist of IFN-I signaling。

TMUV-NS5是IFN-I信号传导的主要抑制剂

迄今为止，多种黄病毒已被证明抑制IFN-I信号通路，NS蛋白 always play essential roles。接下来，为确定哪种病毒蛋白拮抗IFN-I信号传导，生成了分别编码七种TMUV NS蛋白与HA epitope tag融合的质粒，并将每种与HEK293细胞共转染（连同pISRE-TA-luc和pRL-SV40）。经IFN-α处理12小时后，通过双荧光素酶报告 assay 测量荧光素酶活性。结果显示，与阴性对照（pCAGGS-HA空载体）相比，IFN-α诱导的ISRE启动子活性在NS5表达细胞中显著抑制，并以剂量依赖性方式降低。该现象也在IFN-β刺激的细胞中观察到，测试的ISGs的mRNA水平被TMUV-NS5显著下调。这些数据表明NS5蛋白是TMUV感染后IFN-I信号传导的主要抑制剂。

ISGF3异源三聚体形成不受TMUV-NS5抑制

IFN-I与IFNARs结合后，JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2发生磷酸化。为研究这些关键参与者是否受TMUV-NS5直接影响，将HEK293细胞转染HA-NS5，然后用IFN-α处理30分钟。虽然IFNAR1、JAK1、IRF9、STAT1和STAT2蛋白水平在存在或不存在NS5蛋白及IFN-α处理后未显示显著差异，但磷酸化JAK1（pJAK1）、pSTAT1和pSTAT2的水平与mock处理的细胞相比 greatly increased。然而，有或无NS5转染未观察到差异。这些结果表明TMUV-NS5不降低JAK1、IFNAR1、STATs的蛋白水平或其磷酸化状态 after IFN-α stimulation。

此外，检查了TMUV-NS5与STAT1和STAT2的结合能力。将HEK293细胞转染HA标记的TMUV-NS5或ZIKV-NS5（作为阳性对照），随后用IFN-α（1,000 U/ml）处理30分钟。用HA-tag抗体进行免疫沉淀（IP），随后用STAT1和STAT2抗体进行免疫印迹（IB），检测到ZIKV-NS5可与STAT2相互作用，而TMUV-NS5与任何STATs均无结合。

当受IFN-I刺激时，磷酸化的STAT1和STAT2形成异源二聚体，然后与IRF9结合形成ISGF3复合物。为确定TMUV-NS5是否影响ISGF3的形成，将HeLa和HEK293细胞与Myc-STAT1和HA-NS5共转染，然后用IFN-α（1,000 U/mL）处理细胞30分钟。用Myc-tag抗体进行IP，随后用pSTAT2或IRF9抗体进行IB，表明有或无NS5转染未观察到明显差异。这些数据表明ISGF3的形成不受TMUV-NS5显著影响。

TMUV-NS5中断STATs的核积累

ISGF3是导致先天抗病毒 immunity所需靶基因表达的主要信号。它进入细胞核，然后通过与ISRE结合启动基因转录。为检查STATs的转位步骤是否受TMUV-NS5抑制，将HeLa细胞转染HA-NS5，随后用IFN-α（1,000 U/mL）刺激细胞30分钟。共聚焦显微镜显示，IFN-α处理后，大部分pSTAT1和pSTAT2转位到细胞核；然而，在NS5表达细胞中，它们 largely remained in the cytoplasm。通过分离IFN-α处理后细胞的核和胞质组分，并通过WB检测这些两组分中的磷酸化STATs，进一步证实了这一点。IFN-α刺激后，核组分中发现的pSTAT1和pSTAT2多于胞质。相反，在存在TMUV-NS5的情况下，核pSTAT水平降低，并 largely remained in the cytoplasm。此外，研究了TMUV感染对IFN-I信号通路的影响。将HEK293细胞用TMUV（MOI = 1）感染或mock感染24小时，然后用IFN-α（500 U/mL）处理30分钟。如图所示，TMUV对关键转录因子的水平或磷酸化状态无影响，而pSTATs向细胞核的转位过程显著抑制。然而，这种抑制似乎不如NS5单独转染的效果明显。潜在原因可能主要在于病毒感染 often initiates a cascade of highly complex processes，并且 specifically，由某些病毒成分（包括ssRNA和dsRNA）介导的IFN-I激活可以部分抵消NS5的拮抗作用。总之，这些数据表明TMUV-NS5抑制IFN-α处理后STATs的核积累。

TMUV-NS5与KPNAs相互作用并抑制STAT1核转移

刺激后，pSTAT1主要在KPNA1的协助下在核内积累，KPNA1作为特异性NLS受体发挥作用。随后，研究了TMUV-NS5是否中断STAT1与KPNA1之间的相互作用。将HeLa和HEK293细胞与编码HA-NS5和Myc-KPNA1的质粒共转染。使用空载体（pCAGGS-HA）作为对照。转染24小时后添加IFN-α，然后收获细胞进行 co-IP（co-IP） assay。结果显示，在TMUV-NS5转染的细胞中，pSTAT1与KPNA1的共沉淀显著低于对照，表明NS5蛋白作为pSTAT1-KPNA1结合的抑制剂。

接下来，测定了转染HA-NS5质粒或空载体（pCAGGS-HA）作为对照的细胞的KPNAs蛋白水平。这里，无论是否存在NS5蛋白，对KPNAs（KPNA1、KPNA2、KPNA3、KPNA4、KPNA5和KPNA6）的水平均无显著影响。总之，TMUV-NS5抑制pSTAT1与KPNA1的相互作用，但不改变KPNA1或其他KPNAs的水平。

鉴于TMUV-NS5能够阻止pSTAT1-KPNA1结合但不降低KPNAs蛋白水平，我们质疑它是否可能与KPNA1或其他NLS受体相互作用。因此，将HeLa细胞转染HA-NS5或Vec（HA）并用IFN-α刺激。用抗HA抗体进行 co-IP，并用识别KPNA1~6的抗体通过IB分析沉淀 material。结果显示TMUV-NS5 specifically interacted with KPNA1、KPNA2和KPNA5。接下来，为确认TMUV-NS5与KPNA1的相互作用，将HEK293细胞与HA-NS5和Myc标记的KPNA1（使用pCMV-Myc空载体作为对照）共表达。IFN-α处理后，用抗Myc进行IP并随后用抗HA进行IB的结果显示TMUV-NS5与KPNA1共沉淀。随后，将空载体（pCMV-Myc）或Myc-KPNA1转染到HEK293细胞中，然后用TMUV（MOI = 5）感染或不感染 another 24小时。用IFN-α（500 U/mL）处理30分钟后，当用抗Myc抗体进行 co-IP分析，随后用TMUV-NS5抗体进行IB时，可以检测到KPNA1与NS5之间的相互作用。此外，IFA证明NS5和KPNA1在胞质中共定位，并且NS5阻碍了KPNA1向核内迁移。

KPNAs在胞质中识别并结合货物蛋白，通过importin β结合结构域将它们与KPNB连接，然后介导三聚体复合物与核孔的相互作用。为确定NS5表达细胞中KPNA1与KPNB1的结合活性，将HA-NS5和Myc-KPNA1共转染到HEK293细胞中。用抗Myc进行IP，然后用抗KPNB1进行IB显示KPNA1-KPNB1结合活性不受TMUV-NS5影响。此外，为检测IFN-α是否为TMUV-NS5与KPNA1结合所必需，将共转染的HA-NS5和Myc-KPNA1用IFN-α刺激或不刺激。 co-IP结果显示，无IFN-α处理，TMUV-NS5也可与KPNA1相互作用。这些数据表明TMUV-NS5与KPNA1的相互作用部分抑制了pSTAT1-KPNA1 association，从而解释了NS5蛋白如何抑制pSTAT1核积累。

核输入 machinery在免疫系统中起主要作用。为分析KPNA1对宿主抗病毒状态的影响，将Myc-KPNA1转染到HEK293细胞中（以pCMV-Myc空载体作为对照），随后用TMUV感染（MOI = 1），然后用IFN-α（500 U/mL）处理这些细胞。结果显示，与对照细胞相比，KPNA1过表达 dramatically increased the mRNA levels of ISGs，并且IFN-I的抗病毒效果 restored。因此，得出结论，核转运系统在抗TMUV感染的抗病毒应答中起积极作用。

N端NLS_37–45区域是拮抗IFN-I信号传导的关键

NLS由一段（单部分）或两段（双部分）碱性aa组成，是KPNAs识别的区域。在各种黄病毒中，NS5中RdRp结构域中的经典α/β NLS负责其与KPNAs的相互作用，并且NS5的核积累主要依赖此转运过程。然而，当与相应区域（如位于核内的DENV2/ZIKV-NS5和位于胞质的JEV-NS5）比对时，发现TMUV中的α/β NLS序列不保守。因此，使用PSORT II和cNLS Mapper软件，发现TMUV-NS5 N端的一个潜在区域（37–45位aa）具有典型的2类单部分NLS结构，并且其碱性aa组成与在DENV2 C端18个残基（Cter₁₈）中鉴定的功能性NLS区域 identical。基于上述预测的可能NLS区域，将四个截断体F1（1–223 aa）、F2（37–370 aa）（包括NLS_37–45区域）和F3（46–407 aa）、F4（255–905 aa）（包括α/β NLS区域）克隆到pCAGGS载体中，然后转染到HeLa细胞中。通过IFA，发现NS5-F1和F2截断体在核内检测到，而NS5-F3和F4在胞质中检测到。此外，NLS将GFP携带入核的能力是评估其功能的重要指标。接下来，还将TMUV-NS5的NLS_37–45和α/β NLS与2 × GFP融合，并分别与Myc-KPNA1一起转染到HEK293、HeLa和Vero细胞中。如图所示，NLS_37–45区域与KPNA1有强相互作用，并且足以将2 × GFP完全驱动入核。这些发现表明NLS_37–45在N端是功能性NLS，而非TMUV-NS5中的α/β NLS区域。

最后，构建了两个NS5突变体，删除α/β NLS或NLS_37–45，并将它们与Myc-KPNA1一起转染到HEK293细胞中。24小时后，通过IFA，发现两个突变体均定位于胞质，与野生型NS5相同。然而， co-IP assays显示，删除NLS_37–45后，NS5与KPNA1的相互作用显著减弱。此外，分析了NLS_37–45缺失对ISGs表达的影响。将删除NLS_37–45区域（NS5-Mut）的NS5突变体或pCAGGS-HA空载体转染到HEK293细胞中24小时，并用IFN-α（1,000 U/mL）刺激12或24小时。qRT-PCR分析显示，删除NLS_37–45后，NS5-Mut abolished the capacity of significantly inhibiting ISGs expression。这些结果证实NLS_37–45是TMUV-NS5与KPNAs相互作用并抑制IFN-I信号传导的关键区域。

功能性TMUV-NS5 NLS_37–45区域的进一步分析

黄病毒NS5蛋白具有不同的核定位，据报道DENV2和ZIKV的NS5在核内积累，而JEV-NS5和DENV4-NS5在胞质中发现。在本研究中，观察到TMUV-NS5位于胞质，如先前报道。接下来，为验证TMUV-NS5是否在胞质和核之间穿梭，使用核输出抑制剂leptomycin B（LMB）在处理前和处理后转染HeLa细胞8或16小时。发现NS5蛋白仍然未出现在核内。此外，为确定IFN-I刺激是否改变TMUV-NS5的定位，将HeLa细胞转染HA-NS5 24小时，然后用IFN-α（1,000 U/mL）处理。IFA结果显示IFN-α处理未改变其 location。

我们已经鉴定了TMUV-NS5与KPNAs的相互作用，但NS5定位于胞质。这一现象引起了我们的兴趣，根据上述数据（NS5的F1和F2截断体定位于核），我们推测它可能与货物蛋白的大小有关。因此，为进一步分析这一点，构建了NLS_37–45?2 × GFP、NLS_37–45?3 × GFP（具有与RdRp结构域相似的分子量）和NLS_37–45?4 × GFP（具有与NS5蛋白相似的分子量）表达载体。随后，将这些载体转染到HeLa细胞中24小时。IFA分析显示，除4 × GFP外，2 × GFP和3 × GFP在NLS_37–45的关联下均可完全定位于核，表明功能性NLS的携带能力与货物蛋白的大小密切相关。类似地，原本定位于胞质的RdRp结构域，当在其N端添加NLS_37–45时，转位入核，并与KPNA1表现出强相互作用。

有趣的是，DENV2-NS5在其Cter₁₈具有典型的NLS，定位于核，但TMUV-NS5见于胞质，尽管NLS_37–45具有相同的碱性aa组成。这表明分子量不是影响货物蛋白入核的唯一因素。因此，接下来构建了NLS_41–45（截短的NLS_37–45），保留了2类NLS结构，融合了3 × GFP或RdRP结构域质粒。如图所示，NLS_41–45?3 × GFP完全位于核内，但对于NLS_41–45-RdRP（具有与3 × GFP相似的分子量），它在细胞中分散表达。当在TMUV-NS5中替换DENV2功能性α/β NLS和Cter₁₈时，共聚焦显微镜仍然显示这些替换未改变其亚细胞定位，并且在ZIKV-NS5 α/β NLS替换中也观察到这种现象。基于以上数据，我们得出结论，尽管NLS是KPNAs与货物蛋白结合的关键区域，但这些蛋白的细胞定位受多种因素调节，包括但不限于其大小和类型。

讨论

作为抵御病毒感染的第一道防线，先天免疫诱导细胞进入抗病毒状态，从而抑制病毒传播和复制。然而，为成功建立感染，黄病毒进化出了多样化的策略来逃避宿主抗病毒应答，这主要由IFN-I介导，并且NS蛋白起重要作用。在本研究中，证明TMUV（属于黄病毒属）可以阻断IFN-I信号传导，并且其NS5蛋白被确认为JAK-STAT通路的直接和有效病毒抑制剂。当然，除NS5外，我们还发现TMUV的亚基因组黄病毒RNA（sfRNA）对IFN-I的产生甚至其后续信号级联 exert a significant inhibitory effect，与其他黄病毒中的报道一致。目前，我们的研究 focus on the role of NS5，而sfRNA的调查仍在进行中。

免疫逃逸机制表明，LGTV-NS5在IFN刺激下抑制STAT1磷酸化，而JEV-NS5抑制STAT1核转位，以及Tyk2和STAT1的酪氨酸磷酸化。此外，WNV-NS5阻止磷酸化STAT1积累并阻断IFN依赖性基因表达。相比之下，我们的结果确定在存在TMUV-NS5的情况下，关键转录因子（IFNAR、JAK和STATs）的蛋白水平或磷酸化状态不受影响，并且ISGF3异源三聚体 formation is not altered。而且，与DENV、ZIKV和YFV不同，TMUV-NS5不介导STATs结合和降解。相反，当分析ISGF3复合物的核定位时，发现IFN-I激活的STAT1/2未能有效在核内积累。进一步调查显示，TMUV-NS5拮抗磷酸化STATs的核转位过程，并部分损害核转运 machinery。这些数据提供证据表明TMUV-NS5作为IFN-I信号传导的主要抑制剂，并且所涉及的策略值得进一步探索。

受IFN-I刺激后，STAT1通过在701位氨基酸的酪氨酸磷酸化被激活，然后主要通过暴露在酪氨酸磷酸化STAT1（pSTAT1）表面的NLS与KPNA1（importin α5）相互作用，从而促进ISGF3复合物的核转位。在本研究中，证明STATs核转位的减少与其表达、磷酸化或ISGF3形成无关。值得注意的是，pSTAT1与KPNA1之间的相互作用在NS5表达细胞中显著受损。这一现象在口蹄疫病毒（FMDV）的3C^pro或猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的Nsp1β中观察到；然而，关键区别在于未发现KPNA1降解，甚至其他KPNAs（KPNA2~6）的蛋白水平。此外，一些特定病毒蛋白对STAT1运输的拮抗功能源于其与KPNAs的竞争性结合，包括埃博拉病毒（EBOV）的VP24、乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶与KPNA1的相互作用，以及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）的ORF6蛋白束缚KPNA2。与先前描述的拮抗KPNA1-pSTAT1相互作用的机制一致，我们的发现表明TMUV-NS5表现出与KPNAs（1、2和5）结合的类似能力，从而阻断主要因子向核内的转位过程