基于多表位融合蛋白的动物布鲁氏菌病血清学诊断技术开发与评价

本刊推荐：本研究针对布鲁氏菌病血清学诊断中脂多糖（LPS）抗原交叉反应性高的问题，利用生物信息学工具和免疫表位数据库（IEDB）筛选布鲁氏菌B细胞表位，成功构建两种多表位融合蛋白（Fusion Protein 1/2）。经iELISA验证，其在小反刍动物和牛血清样本中展现出高灵敏度（最高93.90%）和特异性（最高97.26%），且交叉反应性显著低于传统LPS及虎红抗原（Rose Bengal Ag），为布鲁氏菌病的精准诊断提供了新型工具。

布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌属（Brucella）细菌引起的人畜共患传染病，对畜牧业造成严重经济损失，并威胁人类健康。当前血清学诊断方法主要依赖脂多糖（LPS）抗原，但其存在交叉反应性问题，导致诊断特异性降低。为克服这一局限，本研究通过生物信息学工具和免疫表位数据库（IEDB）筛选布鲁氏菌B细胞表位，设计并构建了两种多表位融合蛋白，旨在提升诊断准确性。

研究设计与方法

本研究首先从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库下载了布鲁氏菌主要外膜蛋白（Omp19、Omp16、Omp25、Omp2a、Omp31、Omp2b、BP26）及其他抗原蛋白（Cu-Zn超氧化物歧化酶、DnaK、延伸因子Tu）的氨基酸序列。利用三种B细胞线性表位预测工具——ABCpred、BCPred和BepiPred 2.0——对这些序列进行表位预测。筛选出至少两种工具重叠预测且长度大于6个氨基酸的表位作为候选表位。同时，通过IEDB检索已验证的布鲁氏菌B细胞表位，筛选标准包括单克隆抗体结合实验证据、在感染宿主中的阳性反应结果以及线性表位特性。最终，基于预测和已验证表位，设计了两条多表位融合蛋白序列：Fusion Protein 1包含42个表位，分子量约68.6 kDa，等电点（pI）为4.64；Fusion Protein 2包含11个优化表位，分子量约35.1 kDa，pI为4.57。表位之间通过柔性连接肽“GGGS”串联，以维持空间结构和免疫反应性。

蛋白表达与纯化

委托北京蛋白质创新有限公司进行密码子优化和基因合成，并将合成基因克隆至原核表达载体pET30a，转入大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。表达产物经超声破碎、离心后，通过SDS-PAGE检测表达情况。Fusion Protein 1以包涵体形式表达，需经过尿素梯度透析复性；Fusion Protein 2以可溶形式表达。复性后的蛋白通过镍柱亲和层析纯化，纯度超过90%。内毒素水平经检测和去除后，Fusion Protein 1和Fusion Protein 2的内毒素分别从24.55 EU/mL和17.18 EU/mL降至0.132 EU/mL和0.084 EU/mL，符合实验要求。

血清学检测性能评价

采用间接酶联免疫吸附试验（iELISA）评估融合蛋白的诊断性能。实验使用198份小反刍动物血清样本（82阳性、116阴性）和232份牛血清样本（96阳性、136阴性），以LPS和虎红抗原（Rose Bengal Ag）作为对照。结果显示，对于小反刍动物样本，Fusion Protein 2的曲线下面积（AUC）为0.9849，灵敏度93.90%，特异性97.26%，阳性预测值（PPV）95.06%，阴性预测值（NPV）95.73%；Fusion Protein 1的AUC为0.9632，灵敏度81.71%，特异性97.95%。对于牛血清样本，Fusion Protein 2的AUC为0.9664，灵敏度92.71%，特异性90.44%；Fusion Protein 1的AUC为0.8954，灵敏度80.21%，特异性83.82%。两种融合蛋白的性能均接近或优于LPS和虎红抗原，且Fusion Protein 2表现更为稳定。

交叉反应性分析

为评估特异性，研究测试了融合蛋白与六种常见病原体（大肠杆菌O157:H7、耶尔森菌O9、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、李斯特菌）感染血清的交叉反应。结果表明，两种融合蛋白均未出现显著交叉反应（信号噪比S/N均低于2.1），证实其高诊断特异性。

讨论与展望

本研究成功构建的多表位融合蛋白为解决布鲁氏菌病血清学诊断中的交叉反应问题提供了新方案。Fusion Protein 2基于IEDB已验证表位，具有更可靠的实验基础，诊断性能优于基于纯生物信息学预测的Fusion Protein 1。其高灵敏度和特异性，尤其是低交叉反应性，使其在临床诊断和疾病监测中具有应用潜力。未来研究可进一步扩大样本量、优化表位排列与连接肽设计，并探索这些蛋白在疫苗开发中的价值。此外，结合分子检测方法（如PCR）可能进一步提升诊断的准确性。

结论

本研究通过生物信息学和实验验证相结合的策略，开发了两种高效、特异的布鲁氏菌病诊断用多表位融合蛋白，为动物布鲁氏菌病的精准防控提供了新的技术工具。