基于新型探针多重实时PCR系统实现脓毒症的快速精准诊断

本综述推荐一种创新的探针式多重实时PCR（real-time PCR）系统（SEPSI ID/DR panels），可快速（约1小时）直接从阳性血培养（BCs）中鉴定29种微生物和23种耐药基因（AMR），无需核酸提取。该系统灵敏度（96.88–97.8%）、特异性（89.7–100%）优异，能检出常规方法遗漏的病原及耐药标记（如blaGES、blaDHA），显著优化脓毒症诊疗流程，促进抗菌药物合理使用（stewardship），具有重要临床转化潜力。

摘要

脓毒症是一种危急临床综合征，需快速诊断与干预。其发病率因人口老龄化和抗菌药物耐药性（AMR）增加而上升。早期识别与创新技术应用对改善患者预后至关重要。本研究评估两种新型探针式多重实时PCR系统：SEPSI ID和SEPSI DR panels。这些系统可快速鉴定细菌和真菌病原体，同时检测抗生素耐药基因。检测覆盖29种微生物（革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母和霉菌）及23种耐药基因和4种毒力因子。 streamlined工作流程使用2 μL阳性血培养（BCs）肉汤，无需核酸提取，约1小时内出具结果。研究评估了228份BCs和22株经全基因组测序（WGS）表征的分离株。与参考方法相比，SEPSI ID panel灵敏度为96.88%，特异性100%，阳性预测值（PPV）100%；SEPSI DR panel灵敏度97.8%，PPV 89.7%，特异性96.7%。两panel均识别出常规方法未检出的额外病原体和耐药相关靶点。该检测系统有望实现脓毒症的快速准确诊断。未来研究需在不同临床环境中验证其性能，以优化脓毒症管理并改善患者预后。

引言

脓毒症和血流感染（BSIs）与高发病率及死亡率相关。早期实施有效的抗菌治疗（由快速药敏结果指导）可改善患者预后。近年来，脓毒症病例逐渐增多，原因包括老龄化、复杂临床状况和合并症患者增加，以及AMR问题日益严重。COVID-19大流行进一步加剧此状况。AMR对脓毒症的影响不容小觑，常被称为“沉默的大流行”，频繁导致治疗困难，增加发病率和死亡率，延长住院时间，引发并发症和流行聚集，并带来沉重经济负担。应对脓毒症需要临床医生、微生物学家、药理学家和卫生管理者协作制定综合策略。作为时间依赖综合征，脓毒症是紧迫的临床和研究挑战。因此，实验室需采用所有可用创新技术以实现快速诊断。在BSIs/脓毒症诊断路径中，强烈建议适时采集血培养（BCs），因BC-based诊断方法仍是金标准。脓毒症有效治疗需早期识别临床症状并借助使用先进技术的微生物学实验室进行快速检测。这些快速路径提供及时诊断信息，使临床医生能迅速启动靶向治疗。多项研究表明，技术进步主要集中于快速诊断测试（RDTs），但综合征panel和其他多重PCR方法常无法识别许多病原体和靶耐药基因。无BC方法仍缺乏足够灵敏度，无法替代BCs检测BSI病原体。下一代测序（NGS）技术直接使用血液或BCs孵育几小时后进行，前景广阔，但目前仅少数大型实验室能应用，因其昂贵且需专职人员和生物信息学专业知识。因此，目前基于实时PCR技术的方法仍是大多数微生物诊断实验室最简单、经济可持续的方案。故新RDTs的开发、验证和评估备受期待。本研究旨在评估一种新型实时PCR探针系统，用于快速鉴定BSIs/脓毒症患者的细菌和真菌病原体，并检测主要抗生素类别耐药的相关靶基因。

结果

SEPSI ID和SEPSI DR panel组成概述见表1，包括各多重反应中的特定靶标和荧光染料。SEPSI ID panel成功识别了与脓毒症常见的广泛临床重要病原体。最常检测的细菌为大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）。panel还检测了较少见病原体如嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）。这些结果与参考方法（RFM）一致，证明了panel识别这些病原体的可靠性。

具体而言，SEPSI ID panel测试了126份血培养（BC）样本（100份阳性和26份阴性）。4份样本因panel未包含其相应靶标（即棒状杆菌属（Corynebacterium spp.）、牛链球菌（Streptococcus gallolyticus）和罗氏肠杆菌（Enterobacter roggenkampii））而被排除出统计分析。此外，3份样本被归类为假阴性：2份霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）未检出，1份屎肠球菌（E. faecium）在混合BC（RFM检测出大肠杆菌和屎肠球菌阳性）中被遗漏。值得注意的是，SEPSI ID panel识别出2种RFM未检测到的额外病原体（表2）。

26份阴性BC均未产生假阳性（FP）。因此，系统灵敏度为96.88%（95% CI: 95.58%–99.36%）。特异性和PPV均为100%（95% CI: 86.77–100和96.09–100），表明所有阳性结果均为真阳性。阴性预测值（NPV）达89.66%（95% CI: 73.89–96.42），反映了排除假阴性（FNs）的强可靠性（表3和表4）。阳性似然比（LHR+）因无假阳性（即100%特异性）而为无穷大，表明测试在阳性时确认状况的能力极强。阴性似然比（LHR?）为0.03（95% CI: 0.009–0.108），表明阴性结果在患此状况患者中高度不可能。F1分数为98.41%，反映了高性能。

SEPSI DR panel测试了128份BC样本（102份阳性和26份阴性）。SEPSI DR panel识别出比参考方法更广泛的耐药机制，包括若干常规测试未检出的耐药基因如bla_GES和bla_DHA。9份阳性样本被排除出统计评估，因它们对酵母阳性且其靶标未包含在“panfungal target”中。在其余93份阳性BC中，88份结果与RFM一致，5份存在 discrepancies。3份不一致结果被归类为FP，2份为FN。FP中，2份样本因存在bla_AmpC和bla_TEM基因而对大肠杆菌检测阳性，但表型上根据RFM为敏感，可能由于基因未表达。此差异可能由bla_AmpC启动子突变（可抑制基因表达）解释。第三例FP涉及携带bla_CMY基因的奇异变形杆菌菌株，表型似乎未表达。FN归因于对碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌阳性的培养物，仅检出bla_SHV基因，可能因铜绿假单胞菌的碳青霉烯耐药常由孔蛋白丢失/修饰或外排泵过表达等机制介导，这些途径不被SEPSI DR panel及大多数商业分子检测 targeting。最后一例FN为大肠杆菌和万古霉素耐药屎肠球菌的混合感染，SEPSI DR panel未能检测出vanA/B基因。所有结果详见于补充文件2。如预期，26份阴性BC结果为阴性。

SEPSI DR panel灵敏度为97.8%（95% CI: 92.2–99.7），特异性89.7%（95% CI: 72.6–97.8）。PPV为96.7%（95% CI: 90.7–99.3），NPV为92.9%（95% CI: 76.5–99.1）（表4）。LHR+为9.45，表明SEPSI DR panel阳性结果 strongly evidence 耐药基因存在。LHR?为0.02（95% CI: 0.01–0.10），表明阴性结果 highly reliable 排除耐药基因存在。此极低值提示测试在无靶标检出时可 confidently 排除抗菌药物耐药。F1分数为97.2%，反映了PPV与灵敏度间的强平衡，确认了panel的整体诊断准确性。表4提供了两panel结果的全面总结。

如表1所示，SEPSI DR panel揭示了更广泛的耐药机制，包括RFM未识别的基因如bla_GES和bla_DHA（另见补充文件2）。重要的是，SEPSI DR panel对TEM和SHV的引物设计允许检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和窄谱β-内酰胺酶，包括bla_TEM-1/2和bla_SHV-1。这些酶常见于肠杆菌目， confer 对青霉素和第一代头孢菌素的耐药性。这解释了两份样本对氨苄西林的耐药：一份为携带bla_SHV的肺炎克雷伯菌阳性，另一份为携带bla_TEM的奇异变形杆菌阳性（见补充文件2）。参考菌株的药敏试验（AST）结果提供于补充文件2。

最后，表5显示了SEPSI ID和SEPSI DR对ATCC参考菌株和我们收集分离株（经WGS表征）的结果。尽管几乎所有预期靶标均被检测到，WGS揭示了SEPSI DR panel未覆盖的额外耐药基因。值得注意的是，SEPSI DR assay成功识别出大肠杆菌ATCC 25922中的bla_AmpC基因，其显示对头孢西丁敏感性降低，此表型亦由Tracz等报道。重要的是，SEPSI ID和SEPSI DR panels的结果可在约1小时内获得，包括约45分钟扩增步骤，外加数据导出和软件分析时间，总周转时间约1小时（图1）。

讨论

AMR常被称为“沉默的大流行”，是日益增长的担忧，使脓毒症有效治疗更具挑战性。AMR导致发病率、死亡率和医疗成本增加。快速诊断技术如实时PCR对快速准确识别病原体至关重要，允许及时靶向治疗。RDTs带来更好患者预后，优化药物使用，减少对微生物分离株的选择压力， minimize AMR出现，缩短住院时间。

本研究旨在评估一种基于实时PCR探针的新系统在BSIs患者BCs中快速鉴定细菌和真菌病原体及检测抗生素耐药基因的有效性。SEPSI ID和SEPSI DR panels均展示优异诊断性能。具体而言，SEPSI ID panel显示高灵敏度、特异性和PPV。NPV为89.66%，F1分数达98.41%，确认了panel在识别真阳性和真阴性方面的高准确性。此外，低LHR值（0.03）表明阴性测试结果 substantially reduce 可被SEPSI ID panel检测感染的可能性，支持测试的强排除能力，表明阴性结果 highly reliable 排除感染。然而，SEPSI ID panel未识别某些病原体如棒状杆菌属、牛链球菌和罗氏肠杆菌。重要的是，这些病原体虽临床 significant，但相对较少见。棒状杆菌属日益被 recognized 为机会致病菌，尤其在免疫受损患者中。牛链球菌与严重感染和结直肠癌风险增加相关。罗氏肠杆菌是 multidrug-resistant 病原体，在医疗环境中构成重大威胁。

SEPSI DR panel灵敏度97.8%，特异性89.7%，PPV 96.7%，展示了相关诊断能力。此外，F1分数97.2%表明PPV与灵敏度间的强平衡。另外，高LHR+值9.45意味着SEPSI DR panel阳性结果 strongly suggest 耐药基因存在。此值接近通常认为指示高诊断 utility 的阈值，从而 reinforce panel在确认抗菌药物耐药方面的有效性。

重要的是，SEPSI DR panel识别出若干常规方法未检测到的耐药基因，包括bla_GES和bla_DHA，突出了其更广检测能力。扩大诊断覆盖通过 enable 更早、更精确治疗决策改善整体治疗 approach。及时靶向抗菌治疗已被证明加速感染 resolution，导致更短住院时间和改善患者预后。此外，鼓励抗菌药物适当使用有助于减少驱动AMR出现的选择压力。在此背景下，SEPSI DR panel有潜力通过提供详细耐药谱 contribute 抗菌药物管理（stewardship），支持更明智抗生素选择， potentially help 保留抗生素长期 efficacy。panel可能通过减少对广谱药物依赖 help mitigate AMR发展和传播。尽管本研究未直接比较标准护理和新RDT的报告时间，值得注意的是，新系统约1小时内交付结果。相比之下，传统AST通常需要24?48小时，取决于所用方法和涉及微生物。此周转时间大幅减少有潜力显著加速脓毒症管理中的临床决策。这在脓毒症管理中至关重要，因适当治疗每延迟一小时均增加死亡风险。

尽管这些 promising 结果，本研究有几个局限性。首先，样本量相对较小，可能限制 findings 的普遍性。需更大研究确认这些结果并提供更稳健数据。其次，研究在单实验室设置中进行，故结果可能不反映不同临床环境（ expertise 和资源水平各异）中诊断panels的性能。第三，SEPSI ID panel未识别某些病原体，表明panel覆盖不全面。将这些病原体纳入SEPSI ID panel将有益于确保全面识别和感染有效治疗与管理。此外，SEPSI DR panel因一些FP结果展示较低特异性。这是所有分子系统的局限性，可能检测未表达的耐药基因，导致不必要的抗生素治疗。为解决此问题，与临床医生分享分子系统局限性知识很重要。最后，研究未评估这些诊断panels在常规临床实践中实施的 cost-effectiveness，这是广泛采用的重要考虑。未来研究应通过包括更大、多中心研究；扩大可检测病原体和耐药基因范围；评估这些诊断工具在不同医疗设置中的 cost-effectiveness 来 addressing 这些局限性。

总之，尽管有一些局限性，SEPSI ID/DR panels在快速准确识别病原体及其耐药靶基因方面 highly effective，使其成为现代诊断的 invaluable asset。其快速性能加速决策，在改善患者护理与预后中 play 关键角色。采用此技术可 greatly increase 临床有效性并确保及时治疗。

材料与方法

SEPSI ID和SEPSI DR描述

被评估系统正处于CE/IVDR认证中，仅 intended 用于研究。它包含定性、多重实时PCR探针检测，由两个诊断试剂盒组成：SEPSI ID和SEPSI DR。这些试剂盒与罗马大学“Tor Vergata”临床微生物实验室和Elettrobiochimica Srl合作开发。SEPSI ID和SEPSI DR是单测试系统，包含缓冲液、Taq DNA聚合酶、引物和探针的预分装液相。测试分为两条 strip，DR测试6管，ID测试8管，为多重实时PCR所必需（表1）。strips包含所有所需液体试剂，-20°C储存直至使用。测试前，试剂解冻，加入2 μL阳性BC肉汤（无需核酸提取）。引物和探针来自Eurofins。每管中，最多5个靶标（4个靶标加内部对照）可同时检测。使用5种不同荧光染料标记的探针。所用荧光染料为FAM、ROX、Cy5、HEX和Cy5-5， attached 至探针5'端，而非荧光淬灭剂BHQ位于3'端。系统通过使用扩增和检测人基因（ specifically β-actin）的内部对照确保无扩增反应抑制剂。

具体而言，SEPSI ID/DR panel可识别总计29种微生物，包括15种革兰阴性和8种革兰阳性细菌、6种酵母和霉菌（包括panfungal target）、23种耐药基因和4种毒力基因。扩增使用Bio-Rad CFX96系统进行。assay亦在CFX Opus 96 Real-Time系统和Bio-Rad CFX96 Touch系统上验证。所用Taq聚合酶为Air Dryable 4X Direct DNA qPCR Blood。两panel均在1小时内提供最终结果。

引物和探针序列因罗马大学“Tor Vergata” under 专利号102020000018400和10200000018400的知识产权保护而未披露。

panel靶生物体和AMR/毒力基因的选择基于其在BSIs中的临床 relevance 和与AMR的 association。panel包括ESKAPE病原体和其他关键细菌，基于全球和意大利流行病学数据选择。耐药基因靶标 chosen 以覆盖临床环境中最 impactful 的机制。这些基因包括以下β-内酰胺酶基因：bla_KPC、bla_NDM、bla_VIM、bla_IMP、bla_OXA-48、bla_OXA-23、bla_TEM、bla_SHV、bla_CTX-M、bla_GES、bla_CMY、bla_AmpC和bla_DHA-1。这些基因与碳青霉烯和超广谱头孢菌素耐药相关。额外靶标包括mcr（粘菌素耐药）、vanA和vanB（万古霉素耐药）、mecA、mecC和OrfX（甲氧西林耐药）。mgrB基因因其在粘菌素耐药中的作用被纳入，ompK36基因因其对膜 impermeability 的 contribution（尤其在肺炎克雷伯菌中）被纳入。panel还包括azole耐药标记和panfungal target以扩大诊断覆盖。毒力基因（Panton-Valentine杀白细胞素、剥脱毒素A/B、中毒性休克综合征毒素、rmpA和magA）因与 increased 致病性和不良临床结局相关而被选择。这确保panel支持快速提供 actionable 诊断信息用于脓毒症管理。两panel的重复性研究详见于补充文件3。为检测单独或组合（多微生物）靶标进行的交叉反应测试结果报告于补充文件4。

测试样本

本研究包括因疑似脓毒症或BSIs入院的患者。所有来自18岁及以上成年患者的阳性BC样本均前瞻性分析。这些样本每日分批处理，4°C储存直至获得结果。

通过包括总计202份阳性BC评估系统性能：100份用SEPSI ID试剂盒测试，102份用SEPSI DR测试。为排除假阳性结果可能性，我们用两panel测试了26份阴性BC。我们评估新系统性能 alongside RFM。为评估SEPSI DR panel检测耐药基因能力，本研究包括22株来自我们收集的分离株和6株ATCC菌株。这22株分离株中，19株先前通过WGS分析表征，其余3株未测序。

包括的ATCC菌株为粪肠球菌ATCC 29212、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、肺炎克雷伯菌BAA-2814、金黄色葡萄球菌ATCC 28213、大肠杆菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853。这些菌株的抗菌药物敏感性谱 well documented。

PCR检测条件：处理阳性BC肉汤方案

2 μL阳性BC肉汤直接加入strip各孔，使用多通道移液器简化流程。 strips然后用适当光学盖密封。使用CFX96系统按 established 方案进行扩增：95°C初始步骤3分钟，随后35个循环（95°C 10秒，60°C 25秒）。扩增后，使用“Export LIMS Folder”功能导出结果，使用EBC软件（仅用于Bio-Rad仪器）进行数据分析。EBC软件设计用于分析由SEPSI ID和SEPSI DR panels（单独或组合使用）生成的实时PCR数据。扩增步骤后，操作员导出数据供软件处理，软件 then 生成包括病原体识别和相关耐药谱解读的全面报告。目前，方案仅在CFX96系统上验证。

PCR检测条件：处理细菌分离株方案

虽测试 optimized 用于阳性BC样本，它亦可应用于细菌分离株的新鲜菌落。这可通过制备0.5麦氏单位 sterile 蒸馏水细菌悬浮液实现。PCR检测使用2 μL制备的细菌悬浮液按上述BC方案进行。

参考方法

BC-based方法仍是分离和检测涉及BSIs病原体的金标准。BCs从医生怀疑感染（BSI/脓毒症）的患者获取，对成年患者，两套BCs（每套由需氧和厌氧瓶组成）常规在床边接种并立即递送我们微生物学实验室。到达实验室后，BCs在BACTEC FX系统中孵育，那些 identified 为阳性者进行传代培养和革兰染色（涂片显微镜检查）。具体而言，阳性瓶肉汤等分（10 μL）接种巧克力琼脂、血琼脂、哥伦比亚CNA琼脂、沙氏葡萄糖琼脂和麦康凯琼脂（使用WASP自动化系统）。平板在需氧和厌氧条件下37°C孵育24小时。监测细菌菌落生长，使用MALDI-TOF assay鉴定细菌 species。药敏试验（AST）使用Phoenix系统进行。AST结果根据EUCAST临床折点v14.0解读。碳青霉烯酶产生肠杆菌目（CPE）和铜绿假单胞菌的识别使用免疫色谱 assays（NG-Test CARBA 5）。对一些病例，尤其危重患者， upon 检测阳性，BC亦使用BioFire FilmArray BCID2处理，允许识别病原体及主要耐药相关靶标。

统计评估

进行统计分析以评估诊断测试性能。具体而言，我们计算了灵敏度、特异性、PPV、NPV、LHR+和LHR?以评估基于状况存在与否的测试结果概率。总体而言，PPV计算为正确识别病例占总测试数的比例。F1分数（指示PPV与灵敏度间平衡）使用标准统计方法计算。

致谢

我们 gratefully acknowledge “L. Spallanzani”生物样本库设施工作人员的贡献：Gianluca Prota、Alberto Rossi、Valentina Antonelli、Claudia Caparrelli和Claudia Maestripieri，感谢他们在接收和储存分离株方面的 helpful 合作。

M.F.和C. Fontana构思研究，起草和监督手稿。C. Fini、M.C.、A.V.、C.R.、I.P.、A.N.、C.S.和C.D.G.帮助研究的方法学。I.V.、C.R.、C. Fini、A.V.和M.C.亦进行研究的验证。M.F.、C. Fontana、A.V.和A.N.提供研究的数据管理。M.F.、C. Fontana和C.R.帮助手稿的撰写、审阅和编辑。A.V.是项目管理员。所有作者阅读并同意出版版本手稿。

本工作由意大利卫生部通过Ricerca Corrente Linea 3支持。Elettrobiochimica Srl亦通过无条件研究资助支持项目。