白色念珠菌赖氨酸乳酸化修饰的全面解析及其与氟康唑耐受性的探索性关联研究

本综述首次系统性描绘了人类病原真菌白色念珠菌（Candida albicans）的乳酸化修饰谱（lactylome），揭示了其在物种中最高程度的乳酸化修饰水平（7,233个位点，1,608个蛋白）。研究通过高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，结合生物信息学分析，发现乳酸化蛋白广泛参与核糖体功能、中心碳代谢、组蛋白修饰等关键生物学过程，并初步探索了其与氟康唑（fluconazole）耐受性（tolerance）这一区别于耐药性（resistance）的重要临床现象的潜在关联，为理解真菌持久性感染及开发新型抗真菌策略提供了新的视角和可靠基础。

　　

引言

侵袭性念珠菌感染是全球范围内人类健康的严重威胁，白色念珠菌是其主要病原体。治疗选择有限，而药物耐受性进一步加剧了治疗挑战。耐受性（tolerance）不同于由不可逆基因突变介导的耐药性（resistance），它是指药物敏感菌株在高于最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）的药物环境下仍能生长的能力，是表型异质性的体现，与治疗失败和持续性感染直接相关。其机制复杂且动态，涉及可逆的表观遗传修饰、非整倍体和染色体复制等，其中可逆的表观遗传调控被许多权威研究认为是介导耐受性的核心。

蛋白质翻译后修饰（post-translational modification, PTM）是表观遗传调控的重要方式，通过靶向组蛋白等蛋白的氨基酸残基（如赖氨酸）来影响基因表达。目前已记载超过300种PTM类型。近年来，赖氨酸乳酸化（lysine lactylation, Kla）作为一种新型PTM被鉴定出来，其在癌症、神经退行性疾病及微生物致病性中扮演重要角色，然而其在白色念珠菌中的生物学意义此前仍属未知。

材料与方法

本研究使用从艾滋病患者体内分离的白色念珠菌临床株Ca1及其在32 μg/mL氟康唑（fluconazole, FLC）条件下培养获得的耐受细胞（Ca1-T cells）作为研究对象。通过微量肉汤稀释法、纸片扩散法和E-test法评估了菌株的药物敏感性（MIC₅₀）、超MIC生长（supra-MIC growth, SMG）、抑制圈半径（radius of the zone of inhibition, RAD₂₀）和生长分数（fraction of growth, FoG₂₀）。

蛋白质样品经提取、酶切后，使用TMT-10plex试剂盒进行标记。通过高pH反相高效液相色谱（high-pH reverse-phase HPLC）进行分级。利用特异性抗体对Kla修饰肽段进行富集，随后使用纳升液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）在Q Exactive HF-X质谱仪上进行数据采集。原始数据通过MaxQuant软件（v.1.5.2.8）进行数据库搜索和鉴定。

生物信息学分析包括基因本体论（Gene Ontology, GO）、直系同源簇（Clusters of Orthologous Groups, COG）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路注释、结构域富集、 motif分析、亚细胞定位预测以及蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络构建。使用Western blot（WB）验证整体乳酸化水平。

结果

白色念珠菌菌株Ca1的敏感性与耐受性

药敏试验显示，Ca1亲本细胞（parental cells）的MIC₅₀为0.125 μg/mL，而其耐受细胞（Ca1-T）的MIC₅₀与亲本细胞相同，均为0.125 μg/mL。Ca1在48小时表现出明显的拖尾生长（trailing growth），其SMG值为0.49 ± 0.007。纸片扩散法的RAD₂₀与MIC₅₀结果一致，FoG₂₀与SMG结果一致。这些指标证实了Ca1菌株对氟康唑表现为耐受表型，而非耐药。

白色念珠菌Kla位点与蛋白质的全蛋白质组分析

通过LC-MS/MS分析，共鉴定到10,169个修饰位点，分布于1,991个蛋白质上。其中，7,233个位点（位于1,608个蛋白质上）具有定量信息，占白色念珠菌总蛋白质组的10.99%。与已报道的其他物种（如植物病原真菌、原生动物寄生虫、小鼠库普弗细胞、人肝癌细胞等）相比，白色念珠菌表现出迄今为止最高数量的乳酸化位点和蛋白质。亚细胞定位预测显示，乳酸化蛋白广泛分布，其中细胞质蛋白占比最大（40.86%），其次是胞质/核蛋白（23.69%）、细胞外蛋白（20.96%）和线粒体蛋白（5.29%）。

白色念珠菌乳酸化位点的Motif分析

对乳酸化赖氨酸周围-10到+10位的氨基酸序列进行motif分析，共生成25个保守motif。前五位富集的motif及其丰度依次为：AKla（634个肽段）、GKla（515个肽段）、AKla（473个肽段）、KlaA（422个肽段）和A*Kla（375个肽段）。这表明疏水性丙氨酸（A）和中性甘氨酸（G）在Kla位点前富集。该特征与白色念珠菌的琥珀酰化组（succinylome）和2-羟基异丁酰化组（2-hydroxyisobutyrylome）的序列模式相似，提示这些PTM可能利用相同的酶来启动和逆转这些不同的修饰。此外，约27.02%的乳酸化位点位于α-螺旋结构中，6.25%位于β-折叠结构中，其分布与白色念珠菌的乙酰化组和巴豆酰化组相似。

白色念珠菌乳酸化蛋白质的功能富集分析

GO和COG注释显示，这些乳酸化蛋白质主要参与细胞过程（80.41%）、代谢过程（68.53%）和生物调控（33.27%）。分子功能方面，主要富集于催化活性（45.27%）和结合（42.54%）。COG分类表明，乳酸化蛋白广泛参与翻译、核糖体结构与生物发生（12.8%）、PTM、蛋白质转换和分子伴侣（10.1%）等过程。

功能富集分析（GO）显示，乳酸化蛋白显著富集于肽的生物合成与代谢过程、酰胺生物合成过程以及核苷酸磷酸代谢过程。细胞组分方面，主要定位于核糖体和线粒体基质。分子功能方面，大量Kla蛋白与核糖体结构组成和氧化还原酶活性相关。此外，还显著富集于连接酶活性、翻译相关结合、翻译因子活性、氨酰-tRNA连接酶活性等与蛋白质翻译过程密切相关的功能。

KEGG通路富集分析表明，乳酸化蛋白显著富集于核糖体、抗生素生物合成、氨基酸生物合成以及碳代谢等通路。此外，在三羧酸循环（TCA cycle）、糖酵解/糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）和丙酮酸代谢（pyruvate metabolism）等核心代谢通路中也显著富集。结构域富集分析进一步揭示，醛酮还原酶家族、M24金属肽酶家族、核糖体蛋白（L7Ae/L30e/S12e/Gadd45家族）、异柠檬酸/异丙基苹果酸脱氢酶以及核心组蛋白（H2A/H2B/H3/H4）在白色念珠菌中高度富集。这些结果表明乳酸化蛋白广泛参与翻译、代谢和能量产生。

白色念珠菌组蛋白中的乳酸化赖氨酸

乳酸化谱分析揭示了白色念珠菌组蛋白（尤其是H2A/H2B/H3/H4）上存在广泛的乳酸化修饰。与之前研究中获得的2-羟基异丁酰化组、乙酰化组、巴豆酰化组和琥珀酰化组进行比较，发现在42个乳酸化组蛋白位点中，有30个（71.4%）与其他修饰共存，揭示了多位点修饰赖氨酸占主导地位。例如，H2B.1（K82和K88）同时存在Kla、Kcr、Ksuc和Khib；H4（K61和K93）同时携带Kla、Kac、Kcr和Khib。进化上保守的组蛋白位点，如H2B.1K22/K46、H4K33和H3K23/K79，也表现出除乳酸化之外的多重酰化模式。特别是H3K23（一个特征明确的表观遗传热点）在白色念珠菌中同时存在Kla、Kac和Khib，而H3K79（一个保守的修饰节点）则同时存在Kla、Kcr和Khib。这种组合修饰网络暗示了酰化交叉对话在调控白色念珠菌特定生物学过程中染色质可及性的功能协调性。

白色念珠菌中多重PTM修饰蛋白质的PPI网络分析

基于乙酰化组、琥珀酰化组、巴豆酰化组和2-羟基异丁酰化组，对乳酸化蛋白质进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，生成了87个簇。PPI网络将所有乳酸化蛋白作为节点，通过物理和功能相互作用直接连接了980个蛋白质。在这980个乳酸化蛋白中，有136个同时包含其他四种PTM。修饰最广泛的10个蛋白质是：Hsp90、Ssa1、Eno1、Eft2、Cef3、Fas1、Ssb1、Ssc1、Met6和Ssa2，它们主要执行翻译活性并响应刺激和压力。

研究进一步展示了乳酸化、乙酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和2-羟基异丁酰化在四个高度互连的簇和三个关键代谢通路中的共存情况：核糖体、氧化磷酸化和蛋白酶体。在这些乳酸化蛋白中，74个核糖体蛋白被归类为簇1，其中22个核糖体蛋白包含五种修饰；23个参与核糖体生物发生的蛋白被归类为簇2，其中16个蛋白同时经历2-羟基异丁酰化、巴豆酰化和乳酸化；27个乳酸化蛋白被归类为簇3，与蛋白酶体活性相关；16个乳酸化蛋白被归类为簇6，与氧化磷酸化密切相关。有趣的是，在簇3中，85%（23/27）的蛋白质同时被三种或以上类型的修饰所修饰；而在簇6中，88%（14/16）的蛋白质被三种或以上修饰所修饰。

Ca1亲本细胞与耐受细胞之间DLPs的全蛋白质组分析

研究评估了全面的蛋白质乳酸化水平，观察到Ca1和Ca1-T之间的乳酸化存在显著差异，表明蛋白质乳酸化可能在抗真菌药物耐受性的发展中起作用。总共鉴定出91个上调的差异乳酸化蛋白（differentially lactylated proteins, DLPs）和126个修饰位点，以及371个下调的DLPs和540个修饰位点。根据其变化倍数（fold change）值将这些DLPs分为四组（Q1至Q4）。其中，47个蛋白显著上调（>1.5倍），166个蛋白显著下调（<0.667倍）。

基于GO注释的DLPs生物学功能显示，DLPs主要涉及细胞和代谢过程、生物调控、对刺激的反应以及催化活性。COG分类显示，DLPs主要集中在翻译、核糖体结构与生物发生、能量产生与转换以及PTM、蛋白质转换和分子伴侣。亚细胞定位预测显示，DLPs主要定位于细胞核、细胞质和线粒体。

基于GO富集的聚类分析显示，显著下调的DLPs（Q1, <0.667倍）主要与醇的生物合成与代谢过程、有机羟基化合物生物合成过程、固醇/类固醇生物合成过程、结合和催化活性以及mRNA释放后剪接体复合物相关。相反，显著上调的DLPs（Q4, >1.5倍）在谷氨酸脱氢酶[NAD(P)+]活性、单加氧酶活性、核糖体和质膜方面富集。Q2组（0.667~0.769倍）的DLPs在有机酸代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和ATP生成以及电子转移活性、醛/醇脱氢酶（NAD+）活性和谷氨酰胺水解活性等分子功能方面显著富集。Q3组（1.3~1.5倍）的DLPs主要富集于碳水化合物跨膜转运活性。

基于KEGG通路富集的聚类分析结果显示，下调的DLPs主要与糖酵解/糖异生、氨酰-tRNA生物合成和碳代谢相关，而氮代谢通路、泛醌生物合成、磷酸戊糖途径和核糖体在Ca1-T中显著上调。这些发现表明，Kla可能通过下调糖酵解/糖异生和中心碳代谢通路，同时上调抗氧化应激反应通路，来潜在地调控能量代谢的稳态，从而增强细胞在药物压力下的生存能力。

基于蛋白质结构域的聚类分析表明，与谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸脱氢酶以及核心组蛋白结构域（H2A/H2B/H3/H4）相关的DLPs显著上调，而HMG（高迁移率族）盒、EF-Tu C端和AAA结构域（Cdc48亚家族）则显著下调。

为了进一步验证这些发现，研究使用泛Kla抗体进行了免疫印迹分析，比较了耐受细胞、亲本细胞和耐药细胞之间的乳酸化水平。结果显示，与亲本细胞相比，耐受细胞中的整体乳酸化水平显著升高，而在耐药细胞和亲本细胞之间未观察到显著差异。

讨论

作为一种新近鉴定的新型PTM，赖氨酸乳酸化（Kla）已被证明在癌症、炎症和再生中起着至关重要的作用。然而，探索其在人类病原真菌致病性和药物敏感性中意义的研究仍然有限。本研究是首次对人类病原真菌进行乳酸化组学研究。

乳酸化蛋白广泛存在于各种细胞组分中，并影响细胞内的各种生物学过程。它们参与多种细胞功能，如核糖体生物发生、翻译、碳代谢和PTMs。研究发现，延伸因子Tu（Elongation factor Tu, EF-Tu）蛋白家族共有13个乳酸化蛋白和106个乳酸化位点，它们是GTP酶，以其GTP结合形式将氨酰-tRNA（aa-tRNAs）递送至核糖体。此外，在L7/L12 stalk和EF-G蛋白家族内的蛋白质上也观察到显著的乳酸化修饰，它们在蛋白质翻译过程中作为不可或缺的分子开关发挥作用。基于这些数据，推测乳酸化修饰可能动态调控核糖体复合物组装的精确性和翻译保真度，从而影响白色念珠菌蛋白质生物合成的质量。

组蛋白PTMs是关键的