α-松油醇协同多粘菌素逆转革兰阴性菌耐药性的机制与治疗潜力研究

本研究揭示了植物提取物α-松油醇（α-TP）与多粘菌素（COL）联用可显著恢复耐多粘菌素革兰阴性菌（COL-R GNB）的药物敏感性，通过增强细菌膜通透性、促进活性氧（ROS）积累及破坏生物膜，为临床应对多重耐药（MDR）感染提供了新型联合治疗策略。

　　

ABSTRACT

多重耐药革兰阴性菌（GNB）已成为全球公共卫生安全的重要威胁。多粘菌素（COL）作为治疗GNB感染的最后一道防线，其耐药率随着临床使用量增加而持续攀升。本研究探索了植物提取物α-松油醇（α-TP）在恢复COL耐药菌（COL-R GNB）敏感性方面的潜力。棋盘稀释法和时间-杀菌曲线实验表明，COL与α-TP联用对COL-R GNB表现出显著的体外协同抗菌效应。生物膜实验进一步证实，该联合用药可有效抑制生物膜形成并清除已形成的生物膜。扫描电镜结果显示，联合处理6小时后细菌细胞膜发生严重破损。细胞毒性实验和红细胞溶血分析表明，α-TP在协同浓度下具有较好的安全性。机制研究表明，COL与α-TP联合可促进活性氧（ROS）积累，并增强细菌内外膜的通透性。本研究为COL-R GNB的治疗提供了新的组合方案。

INTRODUCTION

多重耐药（MDR）革兰阴性菌的流行情况日益严重，全球范围内抗菌药物耐药性及多重病原体感染的发生率不断攀升，预计每年将造成超过1050亿美元的经济损失。抗生素不合理使用是导致耐药性加剧的主要原因之一。多粘菌素曾因肾毒性和神经毒性退出临床，但随着MDR GNB感染形势严峻，COL被重新启用并被视为治疗GNB感染的最后选择。然而，染色体突变及耐药基因质粒（如mcr-1）的传播导致COL耐药性不断蔓延。当前COL耐药机制主要包括脂多糖（LPS）结构修饰、双组分系统调控、外排泵过表达以及耐药质粒的广泛传播。

α-TP是一种天然存在于多种植物中的香料成分，广泛应用于香水、食品和化妆品中。其具有抗炎、止痒、镇痛及抗肿瘤等多种药理活性，并对大肠杆菌O157:H7、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌表现出抗菌作用。然而，此前尚未有研究报道α-TP与COL联用用于治疗GNB感染。

RESULTS

Antimicrobial susceptibility tests

本研究使用的菌株中多数为MDR菌（25/32）。这些菌株对COL的MIC均≥4 μg/mL，而对α-TP的MIC均≥512 μg/mL，表明α-TP单药对COL-R GNB抗菌活性较弱。

Checkerboard assay

当与α-TP联用时，COL的MIC值降低了4–2048倍，部分抑菌浓度指数（FICI）介于0.046875–0.5之间，表明COL与α-TP对所有测试菌株均具有协同抗菌效果（FICI ≤ 0.5）。在α-TP存在的情况下，所有COL-R菌株恢复对COL的敏感性。此外，对8株COL敏感菌（COL-S）的联合药敏试验也显示协同效应（FICI 0.1875–0.375）。

Time-kill assays

从32株菌中随机选取8株进行时间-杀菌曲线分析。联合用药在6–12小时内可使大部分菌落数降低≥2 log₁₀ CFU/mL，但在24小时时部分菌株出现再生。除一株A. baumannii（BM1412）外，其余菌株在联合处理12小时后均未检测到细菌生长。

Impact on biofilm formation and eradication

通过结晶紫染色检测8株菌的生物膜抑制与清除能力，结果显示联合用药显著抑制生物膜形成（P < 0.05）并有效清除成熟生物膜（P < 0.05）。活菌计数显示在生物膜抑制实验中7/8菌株、成熟生物膜清除中6/8菌株的菌量显著下降。激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）进一步证实联合处理可减少生物膜内存活细菌。

Safety tests in vitro

使用RAW264.7和HEK-293T细胞评估α-TP及联合用药的细胞毒性，α-TP浓度达512 μg/mL时未显示细胞毒性。小鼠红细胞溶血实验表明，即使α-TP浓度高达1024 μg/mL，单独或联合用药均未引起溶血。

Safety tests in vivo

通过小鼠连续7天腹腔注射化合物后取心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色，组织学特征与对照组相当，未见炎症迹象，初步证实该联合方案在体内具有良好的安全性。

Mechanisms for drug synergy

联合用药的抗菌机制可能与活性氧（ROS）积累、细菌膜结构破坏相关。荧光定量显示，联合处理显著提高了细菌内ROS和超氧阴离子水平。N-苯基-1-萘胺（NPN）和碘化丙啶（PI）染色结果表明，联合用药增强了细菌外膜和内膜通透性。扫描电镜（SEM）图像显示，联合处理导致细菌细胞膜破损和疤痕形成。

Antimicrobial activity in vivo

采用小鼠大腿感染模型评价体内抗菌效果。结果显示，联合用药组（COL 5 mg/kg + α-TP 100 mg/kg）在处理24小时后大腿组织中菌载量显著低于单药组（P < 0.05），证明该组合在体内亦具有协同抗菌作用。

DISCUSSION

世界卫生组织2024年公布的耐药菌名单中，革兰阴性菌占主要部分。COL的肾毒性限制了其临床用量，因此寻找能够增强COL疗效并降低毒性的组合策略具有重要意义。天然植物提取物作为抗菌佐剂显示出广阔前景，如α-TP不仅来源广泛、安全性高，还具有多重药理活性。本研究首次系统评价了α-TP与COL联用对COL-R GNB的协同效应，并初步阐释其通过破坏膜完整性、诱导氧化应激等机制发挥抗菌作用。尽管时间-杀菌实验中观察到部分菌株在24小时再生，提示需优化给药方案，但体内实验充分证明了该组合的治疗潜力。此外，该联合用药对生物膜的清除作用为医院感染防控提供了新思路。后续研究可进一步优化α-TP的药代动力学特性及给药策略，推动其临床转化。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial isolates and growth conditions

32株COL-R GNB临床分离株来源于温州医科大学第一附属医院，于-80°C保存于含30%甘油的LB培养基中。

Antibiotics and chemicals

α-TP购自MedChemExpress，用5%二甲基亚砜（DMSO）溶解。多粘菌素及其他抗生素购自温州康泰生物科技有限公司。

Antimicrobial susceptibility testing

采用肉汤微量稀释法测定MIC，结果依据CLSI 2023标准判读。

Checkerboard assays

通过棋盘法评估联合药效，FICI ≤ 0.5判定为协同作用。

Time-kill assays

选取8株菌，以2×FICI浓度进行时间-杀菌曲线分析，于0、2、4、6、12、24小时取样测定菌落数。

Crystal violet staining assays

使用0.5×FICI浓度抑制生物膜形成，2×FICI清除成熟生物膜，结晶紫染色后测OD₅₉₅。

Count of live bacteria in biofilms

刮取生物膜并进行系列稀释涂板，计数CFU。

CLSM

使用SYTO 9和PI对生物膜进行活/死菌染色，CLSM观察并三维重建。

Cell toxicity

CCK-8法检测化合物对RAW264.7和HEK-293T细胞的毒性。

Hemolysis assay

小鼠红细胞与化合物共孵育后测545 nm吸光度，计算溶血率。

Histological sections of mouse visceral tissues

小鼠连续7天腹腔注射化合物后取脏器进行H&E染色及病理学检查。

Detection of ROS production

采用DCFH-DA荧光探针检测细菌内ROS水平。

Superoxide anion assay

使用DHE荧光染料检测超氧阴离子水平。

Outer membrane permeability

NPN荧光染色评估外膜通透性。

Inner membrane permeability

PI染色评估内膜完整性。

SEM

细菌经联合处理后固定、脱水、喷金，扫描电镜观察形态变化。

In-vivo analyses of synergistic antibacterial effectiveness

建立中性粒细胞减少小鼠大腿感染模型，注射菌液后2小时开始治疗，24小时后取大腿组织称重并计菌落数。

Statistical analysis

使用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，采用t检验或单因素方差分析，P < 0.05认为有统计学差异。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究受浙江省临床检验诊断与转化研究重点实验室（2022E10022）支持。