盐酸决奈达隆靶向心磷脂和磷脂酰甘油以增强革兰阴性病原菌对多粘菌素的敏感性

本研究揭示了抗心律失常药物盐酸决奈达隆（DH）作为新型抗生素佐剂，通过特异性靶向细菌膜磷脂心磷脂（CL）和磷脂酰甘油（PG），破坏膜完整性、耗竭质子动力（PMF）、诱导氧化应激，从而显著逆转多重耐药（MDR）革兰阴性菌对多粘菌素（colistin）的耐药性，为应对全球抗生素耐药危机提供了创新性联合治疗策略。

　　

DH是一种有效的多粘菌素佐剂

多粘菌素是治疗碳青霉烯类耐药革兰阴性菌感染的关键药物，但其耐药性的日益严重限制了临床应用。通过筛选FDA已批准药物库，研究发现盐酸决奈达隆（DH）与多粘菌素具有显著协同效应。棋盘法试验证实DH与多粘菌素对大肠杆菌ECQ001具有优异协同作用（FICI = 0.05 ± 0.00）。生长曲线和杀菌试验显示，单药治疗均不能完全清除细菌，而联合治疗可在24小时内实现完全杀菌。更重要的是，DH的加入减缓了多粘菌素耐药性的发展，与多粘菌素单药治疗相比，MIC值增幅更低（两倍vs四倍）。

研究发现DH同样与多粘菌素协同作用于携带mcr-1质粒的大肠杆菌菌株，且FICI值非常接近，表明DH与多粘菌素的协同作用不依赖于mcr-1的存在。进一步评估对其他革兰阴性菌种的FICI发现，DH能够增强多粘菌素对这些菌株的活性，且与预先存在的多粘菌素耐药性无关。协同杀菌作用证实了DH-多粘菌素组合的广谱活性。这些发现表明DH与多粘菌素联合是消灭革兰阴性菌和减少耐药性出现的有效方法。

DH促进膜通透性和氧化损伤

多粘菌素作为阳离子多肽抗生素，通过静电相互作用与脂质A的阴离子磷酸基团结合，破坏外膜完整性和通透性导致细胞死亡。鉴于DH与多粘菌素在不同革兰阴性菌中均观察到协同作用，推测DH可能通过增强多粘菌素对细菌细胞包膜的破坏作用发挥作用。

采用NPN荧光探针评估大肠杆菌ECQ001外膜通透性发现，添加DH（8 μg/mL）可显著增加外膜通透性。然而，达到相当的通透性增加需要更高浓度的DH（32 μg/mL），表明DH以剂量依赖方式增强多粘菌素活性。内膜完整性试验表明，DH与多粘菌素联合显著提高了膜通透性。细胞膜稳定性降低和半乳糖苷酶释放增加表明联合治疗组细菌死亡率更高。细菌活死染色试验证实DH增强了多粘菌素的杀菌效果。

细菌质子动力（PMF）是位于细菌膜上的能量通路， crucial调控ATP合成、分子主动转运和细菌鞭毛旋转等多种生物过程。PMF通常包括电势（ΔΨ）和跨膜质子梯度（ΔpH）。为研究DH诱导的膜功能障碍程度，研究人员量化了DH与多粘菌素联合处理后ΔΨ和ΔpH的变化。使用对膜电位变化敏感的荧光探针DiSC₃(5)观察到，与未处理对照组相比，联合处理组细菌细胞内荧光强度显著增加，表明细胞质膜发生显著去极化。随后使用pH敏感荧光染料BCECF-AM评估ΔpH变化，结果显示联合处理组ΔpH降低更明显。

考虑到DH和多粘菌素引起的膜完整性改变，研究假设这也会影响细胞质膜内的呼吸链和能量代谢途径。检测暴露于DH和多粘菌素的细菌细胞内ATP水平发现，在DH浓度为2 μg/mL时ATP产量显著降低，表明生物能量功能受损。ATP耗竭可破坏细胞氧化还原状态，导致活性氧（ROS）积累和氧化应激诱导——这是与多粘菌素相关的关键杀菌机制。数据显示随着DH和多粘菌素浓度升高，ROS水平呈剂量依赖性增加。同时观察到超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，表明抗氧化防御系统受损。

DH靶向CL和PG以协同多粘菌素

基于DH增强多粘菌素针对多种细胞成分的破坏活性，研究推测DH直接与外细胞膜的特定成分相互作用。磷脂作为细胞膜的主要成分，在众多生物过程中发挥关键作用，可能是此类相互作用的潜在靶点。

添加大肠杆菌总提取磷脂谱（PE：57.5%；CL：9.8%；PG：15.1%；其他：17.6%）后，观察到DH与多粘菌素的协同效应呈剂量依赖性降低。具体而言，PG和CL完全消除了DH与多粘菌素的协同作用，而PE没有这种影响。为阐明这些观察结果的分子基础，研究进行了等温滴定量热（ITC）试验以量化DH与三种磷脂成分的结合亲和力。正如预期，DH对PG和CL表现出高亲和力，解离常数（K_D）分别为1.3 × 10^?6 M和2.1 × 10^?5 M。相比之下，DH与PE或缓冲液对照没有显著相互作用。值得注意的是，数据显示CL的碳链长度不影响其与DH的结合，表明DH优先结合CL甘油部分的末端基团而不是酰基链。

DH在小鼠感染模型中增强多粘菌素疗效

鉴于DH-多粘菌素组合在体外表现出显著的协同抗菌效果，研究进一步探讨其体内治疗潜力。在体内实验前，评估了DH的溶血活性以确保其安全性。结果表明即使在32 μg/mL浓度下，DH对绵羊红细胞（SRBCs）的溶血作用极小，表明细胞毒性低，适合进一步评估。

采用临床分离大肠杆菌ECQ001的系统性感染小鼠模型评估DH作为抗生素佐剂的疗效。治疗后，与多粘菌素或DH单独治疗组相比，DH-多粘菌素联合治疗组各器官中的细菌负荷显著降低。这些结果为DH与多粘菌素联合的临床应用提供了研究基础，突出了其作为新型辅助疗法应对日益严重的抗生素耐药性挑战的潜力。

讨论

抗生素佐剂代表了一种变革性的药理学策略，可有效缓解抗生素耐药性。重新利用现有药物作为抗生素佐剂具有明显优势，如提高研发成功概率、显著缩短开发时间和降低相关成本。

本研究通过一系列抑菌试验筛选潜在佐剂，最终阐明了DH与多粘菌素联合克服多粘菌素耐药性的能力。研究发现DH将多粘菌素对耐药性ExPEC的MIC降低了约32倍，从而可能在保持疗效的同时减轻多粘菌素的毒理学特征。

ITC和棋盘试验表明DH结合CL（K_D = 2.1 × 10^?5 M）和PG（K_D = 1.3 × 10^?6 M）并恢复对最后 resort抗生素多粘菌素的敏感性。PG和CL是革兰阴性菌细胞膜的重要组成部分。研究证实了先前报道，即靶向这些膜成分的化合物可增强多粘菌素的抗菌功效。鉴于细菌和哺乳动物膜组成的显著差异，选择性靶向细菌膜代表了开发新型抗菌剂和抗生素增强剂的有希望途径。

在大肠杆菌中，其细胞质膜的磷脂组成主要包括PE（约75%）、PG（约20%）和CL（约5%），以及少量其他磷脂如磷脂酰丝氨酸（PS）。DH选择性结合阴离子PG和CL而不是更丰富的PE，强调DH特异性增强多粘菌素的抗菌功效而不对革兰阴性菌产生直接杀菌活性。相比之下，革兰阳性菌的PG比例更高（约50%）和CL（约30%），PE含量较低。这种磷脂分布使研究人员推测DH对革兰阳性菌表现出增强的抗菌活性，这一假设得到研究结果的支持，显示对金黄色葡萄球菌的MIC为8 μg/mL。鉴于哺乳动物细胞膜中PG和CL的存在极少（约1%），DH对真核细胞的细胞毒性潜力显著降低，从而突出了其抗菌应用的治疗窗口。

尽管CL是革兰阴性菌包膜中三种主要甘油磷脂中最不丰富的，但由于大肠杆菌中存在多种 dedicated于其合成的酶（ClsA、ClsB和ClsC），CL发挥着关键作用。这种冗余强调了CL对细菌生存力和适应性的至关重要性。研究阐明了CL与必需蛋白（包括水通道蛋白、DNA重组酶和ATP结合盒转运蛋白）之间的各种生物相互作用。此外，Douglass等人的研究表明，CL促进LPS向革兰阴性菌外膜的运输，可能有助于观察到的DH与多粘菌素之间的协同作用。

材料与方法

研究使用的细菌菌株列于附表。DH和多粘菌素分别购自APExBIO Technology LLC和上海源叶生物科技有限公司。

使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠（18-20克）。感染前，小鼠在标准化环境条件下适应3-5天。所有动物实验均获得吉林大学动物护理与使用委员会批准。

通过棋盘试验测定分数抑制浓度指数（FICI）。根据需要，向肉汤培养基中添加CL、PE、PG或LPS以阐明其他物质对DH与多粘菌素协同作用的影响。

通过生长曲线分析确定DH对细菌生长的影响。时间依赖性杀灭曲线用于确定DH和多粘菌素的杀菌效果。

根据先前报告鉴定DH的溶血活性。简言之，SRBCs与系列稀释的DH在37°C处理1小时。通过测量上清液在OD_{570 nm}处的吸光度值量化DH的溶血活性。

为评估体外耐药性出现，大肠杆菌ECQ001培养物暴露于多粘菌素、DH、它们的组合或溶剂对照24小时。相同过程重复28天，每3天检测所有组的多粘菌素MIC。

使用ITC评估DH与CL或PG在25°C下的亲和力。

使用荧光染料N-苯基-1-萘胺（NPN）测定多粘菌素、DH或组合对大肠杆菌ECQ001外膜通透性的影响。使用碘化丙啶（PI）评估内膜完整性。

使用邻硝基苯β-D-半乳糖吡喃糖苷（ONPG）测定β-半乳糖苷酶活性。

使用8-苯胺基-1-萘磺酸铵（ANS）测试膜流动性。

使用活死背光细菌活力试剂盒进行活死细菌染色。

使用3,3-二丙基硫杂二碳菁碘化物（DisC₃(5)）测量细胞膜去极化。

使用2′,7′-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素（BCECF-AM）量化跨膜ΔpH变化。

使用增强ATP测定试剂盒测量细胞内ATP水平。

根据制造商方案进行ROS测量。使用相应试剂盒测定氧化应激相关因子如SOD活性。

在使用多粘菌素耐药大肠杆菌ECQ001的小鼠系统性感染模型中评估DH和多粘菌素的治疗效果。感染后1小时，用单剂量DH、多粘菌素或组合治疗小鼠。感染后48小时，取腹膜灌洗液、肝脏、脾脏和肾脏并在无菌PBS中匀浆以进行细菌负荷测定。

所有实验至少进行两次独立生物学重复。数据显示为平均值±标准差（SD）。使用GraphPad Prism进行统计分析和图形生成。使用单因素方差分析（ANOVA）和双因素ANOVA分析数据变异性。