头孢唑林联合利奈唑胺或克林霉素对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的体外协同效应评估及E-test方法验证

本研究首次系统评估头孢唑林（CEF）联合利奈唑胺（LIN）或克林霉素（CLI）对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）的体外协同作用。通过棋盘法和E-test法证实两种组合均表现为无关作用（Indifference），但两种方法结果高度一致，凸显E-test法在协同效应筛查中的简便性与可靠性，为临床严重感染的治疗方案优化提供了重要实验依据。

　　

ABSTRACT

抗菌药物联合应用产生的协同作用对于提高治疗金黄色葡萄球菌引起的严重感染的临床疗效具有重要意义。尽管头孢唑林与利奈唑胺联合治疗甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）存在生物学理论基础，但该组合的体外协同作用尚未得到评估。本研究采用棋盘法和E-test法两种协同效应评估方法，对头孢唑林联合利奈唑胺 against 来自两个中心的19株临床MSSA分离株进行了评估，并将结果与头孢唑林联合另一种蛋白质合成抑制剂克林霉素进行了比较。通过棋盘法和联合E-test测定，使用 fractional inhibitory concentration index (FICI) 来确定协同作用。两种方法均证明头孢唑林与利奈唑胺以及头孢唑林与克林霉素的组合表现为无关作用（中位棋盘法FICI分别为1.11和1.25，中位E-test FICI分别为0.99和0.88）。尽管所研究的组合未表现出协同作用，但两种测定方法的结果在分类上是一致的，表明E-test是评估金黄色葡萄球菌分离株协同作用的可靠方法。

IMPORTANCE

头孢唑林与利奈唑胺以及头孢唑林与克林霉素的组合是治疗严重金黄色葡萄球菌感染的潜在临床相关方案。然而，这些组合对临床MSSA分离株的协同作用此前尚未确定。我们进行了棋盘法和E-test协同作用测试，证明这些组合对MSSA分离株是无关的。尽管未发现这些组合的协同作用，但协同效应评估方法的结果一致，凸显了联合梯度扩散法在未来协同效应评估中的潜在优势。由于该方法易于使用且与本研究中的棋盘法在分类上一致，它可能有利于在协同作用测试中的进一步应用，从而有望鉴定出可提高严重金黄色葡萄球菌感染治疗成功率的协同组合。

INTRODUCTION

金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原体，可引起多种感染，包括皮肤和软组织感染，以及菌血症、心内膜炎、肺炎和败血症等危及生命的严重疾病。严重感染持续的高死亡率值得继续研究新的治疗策略以改善患者预后。满足这一需求的策略之一是联合使用现有抗生素以实现协同作用。

尽管已有大量研究探讨金黄色葡萄球菌的抗生素组合，但现有研究很少评估利奈唑胺与β-内酰胺类药物联合 against 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），测试过的组合包括利奈唑胺与美罗培南、亚胺培南、氨苄西林-舒巴坦、苯唑西林、头孢洛林和头孢比普。利奈唑胺具有用于金黄色葡萄球菌联合治疗的潜力，因为它耐受性良好，能有效渗透组织，并且安全性良好，尤其是在短程治疗中。此外，利奈唑胺对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和MSSA均具有活性，目前发现的耐药性有限。根据我们最近关于金黄色葡萄球菌协同作用的系统综述，头孢唑林与利奈唑胺的组合尚未在体外针对MSSA进行评估。

头孢唑林与利奈唑胺的组合对治疗MSSA感染具有潜在的重要临床价值，因为头孢唑林是常用于治疗MSSA的第一代头孢菌素。从体外角度来看，利奈唑胺的作用机制与β-内酰胺类药物不同。利奈唑胺是恶唑烷酮类抗生素中的一种蛋白质合成抑制剂，通过结合50S核糖体亚基发挥作用。利奈唑胺还可以解决β-内酰胺类药物使用的某些缺陷。利奈唑胺的活性不受接种物大小的影响，并且与β-内酰胺类药物对非复制细菌效果较差不同，利奈唑胺对休眠细菌可能具有相对更强的活性。

在本研究中，我们通过棋盘法和联合梯度扩散（E-test）协同效应评估方法，评估了利奈唑胺与头孢唑林联合 against 19株临床MSSA分离株的协同潜力。头孢唑林与克林霉素（一种与利奈唑胺活性相似的蛋白质合成抑制剂）的组合作为对照，并使用相同方法评估了其协同作用。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains

本研究使用了19株独特的MSSA分离株。9株独特分离株来自金黄色葡萄球菌网络自适应平台（SNAP）（菌株1–9），于2014年至2015年间在澳大利亚收集。每种分离株类型有三个重复分离株，用于重复MIC和协同作用测试。分离株与参加SNAP试验的参与者无关。10株临床血流分离株来自埃默里大学研究临床微生物学核心（ICMC）实验室（菌株0013、0073、0048、0137、0022、0180、0021、0314、0670和0861），于2022年至2023年间获得。SNAP分离株通过Maldi-TOF确认为金黄色葡萄球菌，青霉素敏感性通过blaZ PCR确定。六株分离株被确认为青霉素耐药（菌株1、3、6、7、8和9）。埃默里分离株通过Maldi-TOF确认为金黄色葡萄球菌。分离株在使用前储存于12%甘油加上阳离子调节穆勒-辛顿肉汤（CAMHB）中，并于?80°C冷冻。在所有实验中使用ATCC 25923作为对照。

MIC determination

通过金标准肉汤微量稀释（BMD）法测定分离株和对照的最低抑菌浓度（MIC）。将抗生素连续稀释到含有50 μL CAMHB的96孔板中，以达到16 μg/mL–0.0156 μg/mL的浓度范围。然后，加入50 μL 1 × 10⁶ CFU/mL的细菌（细菌在哥伦比亚血琼脂平板（SNAP分离株）或TSA血琼脂（埃默里分离株）上于37°C过夜培养20小时后获得）。SNAP分离株在37°C培养18–20小时，在200 RPM下振荡15分钟（37°C），然后放回静态37°C培养箱中再培养2小时。使用Tecan Infinite M200 Pro在OD₆₀₀下测量生长情况并进行肉眼验证。埃默里分离株在37°C培养18–20小时，然后通过肉眼判定MIC。按照制造商（LioFilChem Inc.）的建议，使用E-test判读SNAP分离株的MIC。将分离株在CAMHB中于37°C过夜培养，并使用McF密度计DEN-1（Grant-Bio）稀释至0.5麦氏单位（McF）。使用无菌棉签将浓菌液涂布在穆勒-辛顿琼脂（MHA）平板上。然后将E-test条放置在平板上，于37°C培养20小时。评估抑菌圈并记录MIC。未测定埃默里分离株的E-test MIC。

Synergy testing

使用微量肉汤稀释技术为每个分离株制备棋盘法测定板。将抗生素连续稀释，使得相应待测分离株的MIC位于每个抗生素板的中间位置。将分离株在哥伦比亚血琼脂（SNAP分离株）或TSA血琼脂（埃默里分离株）上过夜培养，并将单个菌落稀释于CAMHB中。SNAP分离株首先稀释至0.5 McF，然后进一步稀释以达到~7.5×10⁵ CFU/mL。埃默里分离株稀释至0.5 McF，然后稀释以达到~7.5×10⁵ CFU/mL。所有棋盘法的CFU/mL均经过确认，范围在1.0 × 10⁵ 至 5.7 × 10⁶ CFU/mL之间。然后将100 μL细菌添加到棋盘法所有含有100 uL抗生素的孔中，不包括一个不含抗生素的孔作为污染对照。对于SNAP分离株，棋盘法板在37°C培养20小时，然后在200 RPM和37°C下振荡15分钟。将板放回37°C培养箱中再培养2小时。使用Tecan infinite M200 Pro在OD₆₀₀下测量细菌生长。埃默里分离株振荡培养15分钟，然后放回静态37°C培养箱中培养20小时。使用BioTek Eon, Gen5软件测量OD。然后根据NCLSS标准计算 fractional inhibitory concentration index (FICI)，公式如下：ΣFIC = FIC_A + FIC_B，其中FIC_A = MIC_{(A在B存在下)} / MIC_(A单独)，FIC_B = MIC_{(B在A存在下)} / MIC_(B单独)。FIC指数≤0.5表示协同作用，0.5 < FIC ≤ 4表示无关作用，FIC >4表示拮抗作用。对于每个棋盘法板，确定所有重复的平均、最小和最大FICI。每个板的平均FICI用于确定协同作用，下文称为FICI。平均、最小和最大FICI结果以所有测试重复的平均值表示。同时，进行联合E-test测定以确定协同作用。将过夜培养的单个菌落分离株使用McF密度计DEN-1（Grant-Bio）（SNAP分离株）或Vitek DensiCheck（埃默里分离株）稀释至0.5 McF标准。使用无菌棉签在穆勒-辛顿或CAMBH琼脂上制作细菌菌苔。将E-test条以90°交叉放置，交叉点位于先前确定的MIC处。将E-test板在37°C培养20小时。对于两组分离株，通过肉眼评估组合中的MIC，按前述方法计算FIC，并确定协同作用结果。

对每种临床分离株类型进行了至少三次独立的协同作用测试。结果以每次独特分离株协同评估的平均值或中位数表示。

RESULTS

MICs

通过BMD和E-test方法测定了19株临床MSSA分离株和对照分离株ATCC 25923的MIC。根据BMD法，ATCC 25923对头孢唑林、克林霉素和利奈唑胺的MIC分别为0.25 μg/mL、0.0625 μg/mL和2 μg/mL。通过E-test法，MIC分别为0.5 μg/mL（头孢唑林）、0.125 μg/mL（克林霉素）和3 μg/mL（利奈唑胺）。临床分离株对所有抗生素均敏感。所有测试分离株通过BMD法测得的头孢唑林中位MIC为0.25 μg/mL（范围0.125–1 μg/mL），克林霉素中位MIC为0.125 μg/mL（范围0.0625–0.25μg/mL），利奈唑胺中位MIC为2 μg/mL（范围1–4 μg/mL）。

Checkerboard assay for synergy

通过棋盘法确定的协同作用对于头孢唑林联合利奈唑胺和头孢唑林联合克林霉素这两种组合是相似的。头孢唑林和利奈唑胺对所有分离株均表现为无关作用（0.5 < FICI < 4），每个分离株的平均FICI见表2。该组合 across isolates 的中位FICI为1.11（范围0.87至1.33）。头孢唑林和克林霉素的组合也表现为无关作用，中位FICI为1.25（1.03–1.69）。任何分离株对于任一组合均未表现出协同作用或拮抗作用。

E-test for synergy

通过E-test方法进行的协同作用评估显示出与棋盘法相似的结果。针对所有临床分离株，两种测试组合均被鉴定为无关作用。根据E-test法，头孢唑林和利奈唑胺组合的中位FICI为0.99（0.75–1.29）。头孢唑林和克林霉素组合的中位FICI为0.88（0.59–1.31）。这些发现表明这些抗菌药物组合不具有协同作用。无关作用的鉴定在E-test和棋盘法之间是一致的，表明这些方法对这些抗生素组合具有分类一致性，尽管数值相关性不同（r = ?0.32, 95% CI:?0.58 to 0.00）。

DISCUSSION

这是第一项评估头孢唑林与利奈唑胺联合 against MSSA 的协同效应的研究。我们证明，通过棋盘法和E-test法，该组合对所有分离株都是无关的。作为对照的头孢唑林与克林霉素的组合也显示出相似的结果，棋盘法和E-test法一致地得出无关作用的结果。

这些组合被鉴定为无关作用可能归因于联合使用时抗生素的作用机制。头孢菌素通过与青霉素结合蛋白相互作用来抑制细胞壁合成。然而，包括利奈唑胺和克林霉素在内的蛋白质合成抑制剂会抑制蛋白质合成，这可能会影响头孢菌素与青霉素结合蛋白结合的能力。然而，这一点有待在本研究测试的组合中得到正式证明，并且在本研究中并未通过拮抗作用的鉴定反映出来。

这些结果与先前对利奈唑胺与其他头孢菌素的协同作用评估一致。Romero等人证明，利奈唑胺与头孢洛林的组合对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和MSSA的协同作用都很弱，在使用E-test以MIC:MIC比率测试的31株分离株中，只有1株显示出协同作用（FICI ≤0.5）。其余分离株对该组合表现出相加/无关作用（>0.5至≤4）。García等人进行的一项类似研究使用E-test评估利奈唑胺与头孢洛林 against MRSA和耐甲氧西林及利奈唑胺金黄色葡萄球菌（MLRSA），同样在71株测试分离株中仅鉴定出1例协同作用。然而，在另一项针对利奈唑胺敏感MRSA分离株的研究中，当使用棋盘法评估头孢曲松与利奈唑胺的组合时，证明对大多数测试分离株（23/30）具有协同作用（FIC ≤0.5，中位FIC 0.3）。这些研究之间的分歧可能取决于所评估的β-内酰胺抗生素或分离株，而不是不同的方法，因为我们通过并行棋盘法和E-test评估证明这两种方法是可比的。或者，协同作用是一种不常见的表型，仅限于整个金黄色葡萄球菌群体中的一个子集。

E-test法在协同作用测试中的应用一直有限；然而，与棋盘法和时间杀菌曲线 assay 等其他体外协同作用测试方法相比，它们在简单性和易于解释性方面具有显著优势。与我们的发现一致，White等人证明，当针对ATCC 29213测试几种组合时，两种方法之间具有一致性。我们的研究通过评估更多数量的分离株支持了这一发现，并表明应考虑将E-test用于未来的协同作用评估，以便能够评估更多数量的分离株和抗生素组合进行协同作用测试，并随后转化到临床实验室环境中。

我们的研究局限性在于，我们仅在一个不能代表高细菌负载的接种量下进行了棋盘法 assay。当使用高细菌接种量进行评估时，可能会显现出协同作用，此时β-内酰胺类药物效果较差，而蛋白质合成抑制剂相对更有效。该组合的协同作用评估并未评估蛋白质合成抑制剂所提出的外毒素抑制的临床益处。这种效应在金黄色葡萄球菌引起的毒素介导的感染中可能很重要。未来的研究应采用高接种量 assay，将协同作用结果与标准接种量进行比较，并测量头孢菌素与利奈唑胺和克林霉素测试组合的蛋白质表达。本研究的另一个局限性是进行协同作用测试的研究所之间方法学存在差异。然而，两个机构在无关作用分类上的一致性令人信服地表明结果是可比的，特别是考虑到两个站点采用了不同的方法学。

综上所述，我们的研究强调头孢唑林与利奈唑胺或头孢唑林与克林霉素的组合是无关的。然而，我们证明了对许多MSSA分离株，棋盘法和E-test法在协同作用判定上具有一致性。由于E-test法易于使用，采用这种方法进行未来的协同作用评估可能是合适的，以便更广泛、更快速地评估抗菌药物协同组合。

ACKNOWLEDGMENTS

AB部分得到了抗菌药物耐药性领导组早期Faculty Seedling Award的支持[国家过敏和传染病研究所UM1AI104681]。