GeneXpert呼吸道病原体检测原型性能分析：与BioFire FilmArray及Hologic Panther Fusion的多中心回顾性比较研究

本刊推荐：本研究系统评估了GeneXpert呼吸道检测面板（GX-RP）原型在诊断上呼吸道感染（URI）中的性能。结果显示，GX-RP与FDA批准的BioFire FilmArray（FA）及Hologic Panther Fusion（PF）检测系统具有高度一致性（总体符合率92.1%），阳性符合率（PPA）达93.1%，阴性符合率（NPA）为99.9%，校正卡帕值（PABAK）达99.0%。该研究为多重PCR呼吸道病原体检测提供了新的可靠选择，具有重要临床推广价值。

　　

ABSTRACT

GeneXpert呼吸道面板（GX-RP）是一种新型体外定性多重核酸扩增检测方法，旨在同时检测和识别26种常见呼吸道病原体，适用于具有上呼吸道感染症状患者的鼻咽拭子（NPS）样本。本研究为一项回顾性研究，将该原型检测与两种FDA批准的呼吸道面板——BioFire FilmArray（FA） Respiratory 2.1 plus及Hologic Panther Fusion（PF）呼吸道检测进行了比较。共收集来自中国香港特别行政区三家医院的292份具有上呼吸道感染症状患者的NPS样本。结果显示，269份样本（92.1%）结果一致，其中甲型流感（Flu A）、百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）和肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）检测结果完全一致。在不一致样本中，7份仅GX-RP阳性，16份仅对照检测阳性。不一致结果中60.9%存在共检测现象。GX-RP的总体阳性符合率（PPA）为93.1%，阴性符合率（NPA）为99.9%，流行校正偏倚校正卡帕值（PABAK）为99.0%。与FA呼吸道面板或PF呼吸道检测相比，GX-RP表现出良好的一致性。

IMPORTANCE

多重呼吸道病原体检测面板是上呼吸道症状患者诊断的主要手段。随着时间推移，新平台和改进版本不断涌现。利用真实世界数据早期评估其诊断性能对于进行必要修订至关重要，有助于公众获得更优质的检测面板。我们的回顾性研究初步证明，GeneXpert呼吸道面板原型检测与BioFire FilmArray和Hologic Panther Fusion呼吸道检测具有相当性能，可能成为未来应对上呼吸道病原体的重要工具。

INTRODUCTION

上呼吸道感染（URIs）是全球急性疾病的主要原因，占全球疾病和损伤总负担的40%以上。虽然罕见导致死亡，但其高发病率给经济和医疗系统带来沉重负担。URIs还可能引发更严重的下呼吸道感染，其住院率和死亡率更高。使用全面呼吸道面板进行及时诊断，可以快速实施针对性治疗，促进康复并阻断疾病传播。这带来各种下游公共卫生效益，如抗菌药物管理、缩短住院时间、实施适当的感染控制措施，以及在国内和国际范围内进行病原体流行病学监测。近期严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行展示了快速检测在应对URI中的重要性，对于控制流行病和大流行尤为关键。

由于呼吸道症状非特异性，诊断模式正转向综合征诊断，可同时检测多种呼吸道病原体。多重实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测平台在一个反应管中整合了常见呼吸道病原体的特定引物。其周转时间快，最快1小时，对病毒和非典型细菌病原体的诊断率大幅提高。近期多中心RP2+研究显示，SARS-CoV-2大流行期间多种呼吸道病毒活跃传播，表明综合征呼吸道面板对精确诊断的必要性。

大多数URIs主要由病毒引起，但也可由细菌引起。常见病原体包括甲型和乙型流感病毒（Flu A和B）、副流感病毒（PIV）、腺病毒（AdV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人偏肺病毒（hMPV）和鼻病毒/肠道病毒（RV/EV），尽管SARS-CoV-2大流行前后URI病原体存在明显的流行病学转变。2008年首个FDA批准的呼吸道面板可检测14种病毒，处理时间5小时。自此，平台性能显著提升，包括细菌靶点的纳入、更高通量、区分RV/EV的能力、缩短操作人员手工时间，以及快至1小时的处理时间。

本研究旨在通过比较GX-RP原型与两种FDA批准的呼吸道面板——BioFire FilmArray（FA）和Hologic Panther Fusion（PF）呼吸道面板检测，评估其诊断性能。三者可检测病原体的比较见表1。

RESULTS

Demographics

共收集292份鼻咽拭子（NPS）样本，使用GX-RP检测与其两种对照检测——PF/FA进行比较。中位年龄为7岁，范围从1个月至97岁。儿童（年龄<18岁）样本占总样本的65%（191/292）。女性和男性的性别分布分别为123/292（42.1%）和169/292（57.9%）。

GeneXpert呼吸道面板检测

本研究检测到的病原体相对流行率降序排列为：RSV（20.5%）、PIV（17%）、SARS-CoV-2（14.4%）、Flu A（10.9%）、RV/EV（10.9%）、AdV和冠状病毒（6.9%）、Flu B（3.8%）、肺炎支原体（2.6%）、副百日咳鲍特菌和百日咳鲍特菌（<1%）。本研究中存档样本未检测到Flu A-H1-pdm09株、中东呼吸综合征病毒（MERS）或肺炎衣原体。

表2总结了各GX-RP分析物的性能特征。GX-RP检测到236个病原体结果，对照检测检测到246个，总体阳性符合率（PPA）为93.1%（229/246）。除副百日咳鲍特菌（PPA为66.7%，但阳性病例数少，n=2）外，所有分析物PPA均高于80%。除RSV（NPA为96.6%）外，所有分析物阴性符合率（NPA）均高于99%。流行校正偏倚校正卡帕值（PABAK）均高于0.97。GX-RP及其对照检测对各特定分析物显示相似的PPA、NPA、PABAK和McNemar值。当分析物结果汇总时，所有一致性统计量保持相似，但McNemar检验变得统计学显著（P=0.041）。本研究中细菌靶点较少（n≤2），除肺炎支原体（n=6）外。所有均为单一分析物检测，无其他细菌靶点。三份样本涉及不一致结果，其中两份检测与另一种病毒共检测。

Retrospective analysis of discordant results

所有样本中，269/292（92.1%）在GX-RP和对照检测间结果一致，其中197/292（67.5%）为共识阳性，72/292（24.7%）为共识阴性。23/292（7.9%）结果不一致。一致结果中，儿童占136/269（50.6%），且全部为阳性。相反，成人贡献了所有阴性样本和61/197（31.0%）的阳性样本。女性少于男性（38% vs 62%）。不一致结果中，18/23（78.3%）来自儿童，性别分布相似。按年龄和性别分层的一致和不一致结果见表3。

不一致样本的共检测显著多于一致样本（14/23，60.9% vs 16/197，8.1%），优势比为17.1（95% CI：5.9–52.8）。不一致共检测结果中最常见的呼吸道病原体是RV/EV（n=5）和hMPV（n=3）。有7份样本仅GX-RP检测到7种病原体，包括hMPV（n=2）、RV/EV（n=2）、RSV（n=1）、AdV（n=1）和副百日咳鲍特菌（n=1）。许多样本显示晚期扩增，提示分析物水平低，循环阈值（Ct）范围从35.6到44.4。仅副百日咳鲍特菌和一例RV/EV例外，通过熔解曲线法检测。根据制造商指南及与Cepheid进一步咨询，当扩增法未检测到RV/EV时会使用熔解曲线法，但具体内部算法未详细说明。另一方面，有16份样本仅对照检测到17种病原体（一份样本有三个阳性靶点），包括AdV（n=3）、RV/EV（n=3）、CoV（n=2）、Flu B（n=2）、PIV（n=2）、RSV（n=2）、hMPV（n=1）、SARS-CoV2（n=1）和副百日咳鲍特菌（n=1）。其中两个AdV显示晚期扩增，Ct>36。其他AdV通过熔解曲线分析检测。不一致结果的详细信息见表4。

所有使用GX-RP和PF检测的样本进一步分析比较其Ct值（表5）。一致结果显示两种检测间Ct值相似，而不一致病例的Ct值通常高于一致病例，尽管样本量小。

DISCUSSION

Comparison of respiratory panels

本研究比较了GX-RP与FA或PF。尚无特定呼吸道面板被指定为URI检测的金标准。FA和PF均获FDA批准用于标准实验室检测。一项比较PF与FA旧版本（2.0）的研究显示良好一致性，PPA为96.5%，NPA为98.4%，但缺乏其最新版本的直接比较。这两个平台历来提供可靠性能，即使经过多次冻融循环测试。两者均被证明可改善临床结果并产生积极经济影响。

尽管诊断性能相似，但存在关键差异可能影响呼吸道面板的选择。首先，GX-RP和FA的处理时间仅45-60分钟，而PF约需2.5小时（表6）。更快周转时间在高通量平台中效益更大。其次，每种检测覆盖不同病原体，使其更适用于特定人群 depending on临床怀疑。GX-RP和FA检测非典型细菌，可能在儿科人群中更有用。如怀疑MERS，仅FA可可靠检测该病原体。在Flu A爆发中，GX-RP和FA允许亚型分化，可能改善流行病学监测。PF采用模块化综合征方法检测病毒，但不检测MERS或细菌靶点（表1）。第三，PF对所有病毒靶点使用实时扩增，GX-RP对某些病毒使用，允许在适用情况下进行Ct值可量化比较。本研究未知每个病例中选择PA或FA的原因，但以上原因是一些潜在考虑因素。

Diagnostic performance

GX-RP的性能特征与FA和PF相似。一致性统计显示NPA、PPA和PABAK均超过90%。传统一致性统计量（如Kappa）在样本以一致细胞为主时受影响。McNemar检验作为更敏感检测用于发现差异，当每个分析物的检测相加时显示小而统计学显著的差异。这一发现反映了不一致细胞间的不平衡，即GX-RP在与对照检测不一致时更不可能检测到病原体（7对17）。然而，这仅代表少量样本，需要更多不一致结果的研究以更好确定平台间的真实检测差异。

Flu A、PIV、RSV和SARS-CoV-2等靶点显示95%–100%一致性。对于Flu A，如果使用疫苗（如FluMist或其他减毒活流感疫苗）可能出现假阳性，但这些因素未在本研究中探讨。由于Flu A在组水平报告时显示100%一致性，可进一步探讨株特异性准确性，特别是报告具有潜在公共卫生威胁的输入株，如疑似禽流感株（H5和H7）。

Discrepant analysis

早期研究表明，不一致结果可能由于低病毒载量、样本降解、交叉反应、多阳性靶点样本中竞争导致的扩增效率降低，或存档样本处理中的多次冻融步骤。临床病史，如既往感染，也可能重要，突出表现为AdV和RV/EV在上呼吸道残留时间延长，导致假阳性。这些是合理解释，因本研究中大多数不一致结果显示晚期扩增，怀疑分析物水平超出检测阈值限（LoD）。我们认为共检测也可能是影响准确性的关键因素，存在于14/23（60.9%）的不一致样本中（表4）。

AdV历来显示对其他呼吸道面板检测的低敏感性，包括BioFire FA版本1.6，后续商业版本通过纳入更多血清型提高敏感性。本研究显示AdV具有最低PPA之一。可能解释包括低水平分析物，可能低于LoD或检测间亚型覆盖差异，其中GX-RP检测A至E组，而对照检测覆盖A至F组。由于F和G亚群引起胃肠道症状，且一份AdV（表4，案例8）GX-RP未检测到但有水样腹泻，潜在解释可能是由于AdV F亚群未被GX-RP检测但被对照检测到，尽管这可能对一例过度分析且超出呼吸道病原体检测背景。

Limitations

由于本研究回顾性性质，存在几个局限性。本研究中的样本在GX-RP测试前经过冻融，而FA或PF使用新鲜样本。这可能影响GX-RP性能，但本研究发现良好总体性能。比较GX-RP与PF的Ct值相似（表5）。这与先前研究一致，即一次额外冻融循环影响有限。测试新鲜样本仍更可取，前瞻性研究设计可避免此问题。

不一致结果传统上通过重复测试或其他独立方法确认。由于样本量不足，本研究无法进行，这在前瞻性研究中可缓解。研究进一步受一些细菌靶点低流行率阻碍，如百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌，使得有意义解释困难。无检测到的肺炎衣原体或MERS允许进一步分析。

此外，初始研究设计未考虑临床变量如年龄、性别或共存感染，这些可能对性能有显著影响。已知儿童阳性率高于成人，但本研究中儿童样本100%阳性率令人惊讶。我们发现大多数不一致结果发生在儿童中（表3）。未来研究可探讨不同患者亚组是否存在差异性能。

Conclusions

本研究是对GX-RP诊断性能的初步分析，显示与FA或PF相比，在快速诊断URI病原体方面总体良好一致性。研究受回顾性研究设计和小样本量限制。未来研究通过纳入更大样本量和前瞻性研究设计可有意义地指导实践。

MATERIALS AND METHODS

Study design and clinical specimens

本回顾性研究在威尔士亲王医院进行，样本收集自中国香港特别行政区的三家医院（威尔士亲王医院、北区医院和雅丽氏何妙龄那打素医院），时间介于2020年1月至2023年9月。NPSs收集自呈现URI症状（如咳嗽、流鼻涕和喉咙痛）的患者。样本置于3 mL病毒运输培养基中，送实验室立即进行标准护理实验室测试，采用FDA批准的商业检测BioFire FA 2.1 plus呼吸道面板（bioMérieux, Durham, NC）或PF呼吸道面板（Hologic, San Diego, CA），按制造商说明进行。标准测试后，这些样本的等分试样在?70°C储存。基本人口统计信息（包括年龄和性别）在样本收集时收集，并在研究时从数字数据库回顾性检索。样本首先随机选择用于GX-RP原型检测（Cepheid, Sunnyvale, CA）评估。对于低流行病原体，如百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和肺炎支原体，添加PF或FA测试阳性的样本以更好表征PPA。共纳入292份样本。一些病原体在当地不可用，如Flu A H1-pdm 2009株、肺炎衣原体和MERS，无法包括。未尝试进一步添加阳性样本用于其他目的，如更好年龄、性别分布或对照检测测试。选定的存档冷冻样本取回并在环境温度下解冻用于GX-RP测试。本研究中选定的样本中，81份经FA测试，211份经PF测试。然后对样本进行一致性测试。如果检测中所有病原体在GX-RP和对照间结果一致，则样本定义为共识阳性或阴性。不一致样本进一步分析可能解释，包括Ct值（ wherever可用）和共检测存在。传统不一致分析未进行，因许多样本量不足。工作流程见图1。

GX-RP multiplex RT-PCR prototype assay

GX-RP测试是一种自动化体外诊断测试，用于定性检测和区分26种常见呼吸道病原体；AdV（A–E）、冠状病毒（CoV HKU1、NL63、229E和OC43）、Flu A（区分H1-pdm 2009）和Flu B、hMPV、PIV 1–4、RSV A和B、RV/EV、SARS-CoV-2、百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌、肺炎支原体和肺炎衣原体。对照检测靶点相似（表1）。测试在配备GeneXpert 10颜色模块的Cepheid GeneXpert仪器系统上进行。测试在取回的残留样本上进行。约300 μL样本分配至试剂盒中，用于自动样本处理、核酸扩增和使用RT-PCR和熔解峰检测检测样本中的靶序列。以下病原体使用熔解曲线分析检测：偏肺病毒、Flu A H1-pdm 2009、肺炎支原体、肺炎衣原体、副百日咳鲍特菌和百日咳鲍特菌。GX-RP需约1小时/运行。

Comparator assays

使用两种FDA批准的商业检测作为对照，包括FA或PF呼吸道面板。FA呼吸道面板是一种多重巢式PCR，在封闭自主系统中进行，允许同时检测19种病毒和4种细菌（表1）。300 μL样本与样本缓冲液混合并注入测试袋，其中包含核酸提取、扩增和靶检测的所有必要试剂。然后将袋置于FA仪器中。系统软件自动解释终点熔解曲线数据，以提供每个靶点的定性结果。如果至少一个对应检测阳性，则微生物报告为检测到。测试完成时间约1小时。PF呼吸道面板检测与FA相似的病毒范围，无细菌检测（表1）。使用三种不同的多重RT-PCR测试检测和区分呼吸道病毒：（i）Flu A/B/RSV；（ii）AdV/hMPV/RV；和（iii）PIV 1–4。独立面板允许模块化综合征测试。500 μL样本转移至样本裂解管并直接加载到Hologic PF系统。该平台执行自动核酸提取和通过RT-PCR扩增基因靶序列。结果约2.5小时就绪。见表6比较GX-RP和对照方法。

Results and statistical analysis

使用R版本4.2.1进行统计分析，配合R包“epiR”和“fmsb”。PF和FA测试集体称为“对照”。本研究包括的一致性统计类型包括PPA、NPA、PABAK和McNemar卡方检验。PPA和NPA的95%置信区间使用精确区间构建。额外比较统计包括Fisher精确检验，统计学显著性水平设定为P值<0.05。

ACKNOWLEDGMENTS

作者感谢微生物实验室工作人员在本研究中的不懈支持，并感谢Cepheid提供设备、试剂和技术支持以进行此次评估。作者声明无其他利益冲突。