中华穿山甲内源性逆转录病毒（MPERVs）的多样性、进化史及其在跨物种传播中的意义

本研究首次系统鉴定并深入解析了中华穿山甲（Manis pentadactyla）基因组中三类新型内源性逆转录病毒（ERVs）——MPERVs（Alpha、Beta与Gamma属），揭示了其复杂的重组事件、跨物种传播历史及功能结构域的保守性，为哺乳动物逆转录病毒宿主范围扩展和进化动力学提供了关键分子证据。

　　

内源性逆转录病毒（ERVs）作为古代病毒整合入宿主基因组的残余片段，是研究病毒进化的珍贵分子化石。本研究通过对中华穿山甲（Manis pentadactyla）基因组的系统性分析，首次鉴定出三类新型全长内源性逆转录病毒，命名为MPERVs（Manis pentadactyla ERVs），涵盖Alpha、Beta和Gamma逆转录病毒属。通过基因组筛选与系统发育分析，团队重构了其进化历史，揭示了复杂的重组事件与跨物种传播证据。MPERVs的插入时间估算显示其范围从近期至1838万年前，这些病毒保留了保守的逆转录病毒结构域与功能基序，展现出在漫长进化过程中的高度保守性。

基因组筛选与MPERVs的分类鉴定

利用已知逆转录病毒的POL蛋白序列作为探针，研究团队对中华穿山甲基因组（版本GCF_030020395.1）进行BLASTx搜索，初步筛选出27个候选元件。通过基于逆转录酶（RT）序列的系统发育分析，这些元件被确认为聚集于Alpha、Beta和Gammaretroviruses的高支持度分支中，从而正式归类为MPERVs。为进一步避免漏检，研究采用tBLASTn算法进行二次筛查，手动去重后整合初始结果。通过LTR_Finder/LTR_Harvest工具，团队鉴定了侧翼长末端重复序列（LTRs）以及逆转录病毒特异的引物结合位点（PBS）和多嘌呤束（PPT），最终依据ERV命名准则将MPERVs划分为8个谱系，包括ERV-Gamma.an-Mpen（n=1-83）、ERV-Alpha.n-Mpen（n=1-13）等。

MPERVs的基因组结构特征

通过生成各谱系的共有序列，研究发现所有ERV-Gamma.(a-e)-Mpen和ERV-Alpha-Mpen元件均含有与既往报道一致的PBS-Pro和PBS-Phe序列，而ERV-Beta.a-Mpen和ERV-Beta.b-Mpen则呈现与Mason-Pfizer猴病毒（MPMV）匹配的PBS-Lys序列。结构分析表明，除ERV-Beta.b-Mpen因突变降解导致ENV蛋白截短外，其余谱系均保留经典逆转录病毒结构：成对LTRs及三大核心基因（GAG、POL和ENV）。POL蛋白长度在不同谱系间存在差异，Gamma家族成员POL蛋白较长（1048-1185个氨基酸），与鼠白血病病毒（MLV）等高度相似。

保守域数据库（CDD）搜索进一步揭示了MPERVs中典型的逆转录病毒域，如天冬氨酸蛋白酶（AP）域、逆转录酶（RT）域、RNaseH超家族、整合酶核心（rve）域等。值得注意的是，ERV-Gamma.b9-Mpen在ENV与3′-LTR间插入了一个近乎完整的LINE-1元件，可能破坏了ENV功能。

所有MPERVs（除ERV-Alpha-Mpen和ERV-Beta.b-Mpen外）均含有病毒衣壳形成所需的Cys-His盒（CX₂CX₄HX₄C）和病毒颗粒组装关键的PPPY motif。ENV蛋白的跨膜（TM）亚基含有宿主细胞弗林蛋白酶识别的切割位点（K/R-X-K/R-R），以及重叠的融合肽、七肽重复区（HR1和HR2）、免疫抑制域（ISD）和CX₆CC motif（Gamma型Env特征）。胞质尾区则含有病毒粒子Env掺入所需的YXXL motif。ERV-Beta.a-Mpen的GAG蛋白还包含主要同源区（QGxxExxxxFxx）和两个锌指结构域。

MPERVs的进化历史解析

基于长片段GAG（>500 aa）、POL（>600 aa）和ENV（>400 aa）蛋白序列的系统发育分析显示，ERV-Gamma.(a,b,c)-Mpen形成独立高支持度分支（PP=100），表明它们源于外源逆转录病毒的独立内化事件。ERV-Gamma-Mpen与猪内源性逆转录病毒聚类，提示共同祖先起源。短分支长度和高拷贝数表明这些病毒在穿山甲基因组中近期曾活跃增殖。

ERV-Beta-Mpen家族在GAG和POL树中均聚类于Betaretrovirus属，与普通吸血蝠（DrERV）和松鼠猴（SMRV）逆转录病毒亲缘最近。然而，ENV区分析揭示关键分化：ERV-Beta.b-Mpen的ENV蛋白与RDR干扰支系（含ISD motif和CX₆CC特征）聚类，但其表面（SU）亚基完全缺失ASCT1/2受体结合所需的SDGGGXXDXXR motif。核苷酸序列分析证实某些插入位点仍保留该 motif，但由于提前终止密码子导致功能退化，表明该谱系虽属RDR干扰组成员，但已丧失感染性。相比之下，ERV-Beta.a-Mpen的ENV SU和TM域与穿山甲基因组内的Gamma型内源逆转录病毒同源性更高，提示可能发生ENV替换重组事件，从而促进宿主基因组定植。

为评估进化背景，团队使用MPERVs的RT共有序列对NCBI哺乳动物基因组进行BLASTn搜索，仅在马来穿山甲（Manis javanica）中发现显著匹配。侧翼序列分析揭示5个同源插入事件，表明MPERVs可能通过垂直传播存在于两种穿山甲中。

MPERVs相关LTRs与单独LTRs的系统发育分析

研究在中华穿山甲基因组中鉴定出大量单独LTRs（soloLTRs），包括SoloLTR-Alpha.n-Mpen（n=19）、SoloLTR-Gamma.an-Mpen（n=119）等。系统发育分析显示，ERV-Gamma.a-Mpen和ERV-Gamma.b-Mpen的成对LTRs在树拓扑中部分嵌套，提示内化前祖先病毒间的密切进化关系。所有其他家族形成独立单系群。与Dfam数据库比对表明，Alpha和Beta家族LTRs聚类于ERV2组，Gamma家族LTRs则与ERV1组对应。部分MPERVs的单独LTRs和成对LTRs与马来穿山甲来源LTRs紧密聚类，进一步支持垂直传播可能性。

MPERVs插入时间估算

基于成对LTRs分歧的分子钟估算显示，ERV-Gamma-Mpen插入时间为0-1838万年前（Mya），ERV-Beta-Mpen为0-1429 Mya，ERV-Alpha-Mpen为141-347万年前。这些时间接近中华穿山甲与马来穿山甲的分歧时间（约1640万年前），结合哺乳动物中性替代率（2.2×10^?9/位点/年）推算，表明MPERVs可能整合于两种穿山甲共同祖先的基因组中。

讨论与进化意义

本研究揭示了中华穿山甲基因组中三类新型ERVs的复杂进化轨迹。依据国际病毒分类委员会（ICTV）框架，外源逆转录病毒分为7属，但内源逆转录病毒并不严格遵循该分类。ERV-Alpha-Mpen在GAG、POL和ENV系统发育中位于α与β逆转录病毒之间，RT树中却聚类于Alpharetrovirus，提示其可能源于一类已灭绝的外源病毒，并可能扩展了Alpharetrovirus的宿主范围。

Beta逆转录病毒的进化模式尤为引人关注：其LTR长度（387 nt）短于典型Betaretrovirus（通常>1000 nt），且Env蛋白存在γ型替换重组现象。类似事件曾见于蟒蛇ERV（PyERV），其gag-pol区属于II类ERVs（Betaretrovirus相关），而Env基因呈现鼠γ逆转录病毒特征。本研究中，ERV-Beta.a-Mpen和ERV-Beta.b-Mpen的GAG-POL区具Betaretroviral特征，但Env分别呈现γ型同源性与RDR干扰支系特性。其中ERV-Beta.b-Mpen虽为RDR干扰组内源成员，但因SU区功能退化丧失感染性；而ERV-Beta.a-Mpen可能通过ENV交换重组获得γ型Env，从而成功殖民宿主基因组。两者拷贝数差异可能源于不同的重组策略带来的适应性优势。

这些发现不仅丰富了哺乳动物内源逆转录病毒的资源库，也为逆转录病毒在跨物种传播与宿主适应过程中的分子机制提供了关键证据。